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《實驗十酵母核糖核酸的分離及組》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、實驗十 酵母核糖核酸的提取 及RNA的含量測定（苔黑酚法）實驗?zāi)康模毫私夂怂岬慕M分掌握提取核酸和鑒定核酸組分的方法掌握苔黑酚法測定RNA含量的原理和方法。實驗原理：酵母中RNA含量較多,含量可達(dá)2.67～10.0%，DNA很少（0.03～0.516％），提取RNA以酵母最為理想。RNA可溶于堿性溶液，研磨后離心去除沉淀（細(xì)胞碎片），當(dāng)堿被中和后，上清液中加入乙醇可以使解聚的核糖核酸沉淀，離心棄上清液，可得到RNA的粗制品。RNAversusDNA-Stabilityissues一、核酸的水解1.堿水解RNA的磷酯鍵易被堿水堿、DNA的磷酯鍵不易
2、被堿水解。例如，在0.1mol/LNaOH溶液中，RNA幾乎可以完全水解，生成2′-或3′-磷酸核苷；DNA在同樣條件下則不受影響。這種水解性能上的差別，與RNA核糖基上2′-OH的鄰基參與作用有很大的關(guān)系。在RNA水解時，2′-OH首先進(jìn)攻磷酸基，在斷開磷酯鍵的同時形成環(huán)狀磷酸二酯，再在堿的作用形成水解產(chǎn)物。一、核酸的水解2.酸水解核酸分子中的糖苷鍵和磷酸二酯鍵在酸性條件下水解切斷。其中糖苷鍵比磷酸二酯鍵更容易遭到水解。核糖核酸含有核糖、嘌呤堿、嘧啶堿和磷酸各組分。加硫酸煮沸可使其水解，從水解液中可以測出上述組分的存在。（1）核糖糠醛糠醛+甲
3、基苯二酚（地衣酚、苔黑酚）鮮綠色的復(fù)合物（670nm）Fe3+H+（2）嘌呤堿+AgNO3嘌呤堿的銀化物（3）（NH4)2MoO4+H2SO4H2MoO4+(NH4)2SO4H3PO4+12H2MoO4H3P(Mo3O10)4+12H2O+抗壞血酸鉬藍(lán)（660nm）濃氨水器材和試劑器材：乳缽、150ml錐形瓶、水浴鍋、量筒、吸管、滴管、試管及試管架、燒杯、離心機、漏斗試劑：0.2%氫氧化鈉溶液、5%硝酸銀溶液冰醋酸、干酵母、95%乙醇、10%硫酸溶液、濃氨水苔黑酚三氯化鐵溶液定磷試劑（1）17%硫酸溶液將17ml濃硫酸（比重1.84）緩緩加入到
4、83ml水中。（2）2.5%鉬酸銨溶液將2.5g鉬酸銨溶于100ml水中。（3）10%抗壞血酸溶液10g抗壞血酸溶于100ml水中，貯棕色瓶保存。溶液呈淡黃色時可用，如呈深黃或棕色則失敗，需純化抗壞血酸。臨用時將上述3種溶液與水按如下比例混合。17%硫酸溶液：2.5%鉬酸銨溶液：10%抗壞血酸溶液：水=1:1:1:2(V/V)操作1、提取核糖核酸5g酵母+30ml0.2%氫氧化鈉研磨均勻錐形瓶，微波加熱5分鐘，冷卻，離心（4000r/min）10分鐘，取上清液，滴加冰醋酸使提取液呈酸性（pH5—6，石蕊試紙試之），加30ml95%乙醇溶液。注意
5、要一邊攪拌一邊緩緩傾入。待核糖核酸沉淀完全，離心（3000r/min）3分鐘，95%乙醇（每次約10ml）洗滌沉淀兩次（即離心）。2、組分鑒定提取核酸+10%硫酸溶液5ml10分鐘水解液組分鑒定：1）嘌呤堿:硝酸銀溶液1ml+過量濃氨水,出現(xiàn)沉淀到沉淀消失，再滴加1ml水解液，觀察有無嘌呤堿的銀化合物沉淀。（注意先后順序）2）核糖水解液0.5ml+苔黑酚三氯化鐵溶液1ml，加熱至沸1分鐘，觀察溶液顏色變化。沸水浴3）磷酸水解液1ml+定磷試劑1ml觀察現(xiàn)象實驗結(jié)果：水浴苔黑酚法測RNA的含量1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制012345RNA標(biāo)準(zhǔn)液ml00.4
6、0.81.21.62.0蒸餾水ml2.01.61.20.80.40苔黑酚試劑ml2.02.02.02.02.02.0混勻，沸水浴25—45min,冷卻，測各管A670nm,以A670nm為縱坐標(biāo)，RNA量（ug）為橫坐標(biāo)作圖。2、樣品的測定1.0ml樣液+1.0ml蒸餾水+2.0ml苔黑酚試劑，混勻，沸水浴25—45min,測A670nm，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得RNA的質(zhì)量（ug）.
