酵母核糖核酸的分離

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1、實(shí)驗(yàn)6酵母核糖核酸的分離及組分鑒定5’5’3’3’一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆障A法分離酵母RNA的原理與操作過程。了解RNA的組分并掌握定性鑒定的具體方法。二、實(shí)驗(yàn)原理由于RNA的來源和種類很多，因而提取制備方法也各異，一般有苯酚法、去污劑法和鹽酸胍法。其中苯酚法又是實(shí)驗(yàn)室最常用的。組織勻漿用苯酚處理并離心后，RNA即溶于上層被苯酚飽和的水相中，DNA和蛋白質(zhì)則留在苯酚層中，向水層加入乙醇后，RNA即以白色絮狀沉淀析出。此法能較好地除去DNA和蛋白質(zhì)，提取的RNA具有生物活性。酵母細(xì)胞富含核酸，且核酸主要是RNA，含量為干菌體的2.67%~10.0%，而D

2、NA含量較少，僅為0.03%~0.516%。為此提取RNA多以酵母為原料。工業(yè)上制備RNA多選用低成本、適于大規(guī)模操作的稀堿法或濃鹽法。這兩種方法所提取的核酸均為變性的RNA，主要用作制備單核苷酸的原料，其工藝比較簡單。稀堿法是用氫氧化鈉使酵母細(xì)胞壁變性、裂解，然后用酸中和，除去蛋白質(zhì)和菌體后的上清液用乙醇沉淀RNA或調(diào)pH2.5利用等電點(diǎn)沉淀。提取的RNA有不同程度的降解。濃鹽法是用高濃度鹽溶液處理，同時(shí)加熱，以改變細(xì)胞壁的通透性，使核酸從細(xì)胞內(nèi)釋放出來。二、實(shí)驗(yàn)原理RNA含有核糖、嘌呤堿/嘧啶堿和磷酸各組分。加硫酸煮可使RNA水解，從水解液中可

3、用定糖，加鉬酸銨沉淀（或用定磷法）和加銀沉淀等方法測出上述組份的存在。（1）嘌呤堿與硝酸銀作用產(chǎn)生白色的嘌呤銀化合物沉淀。（2）地衣酚顯色法：核糖核酸與濃鹽酸共熱時(shí)，即發(fā)生降解，形成的核糖繼而轉(zhuǎn)變?yōu)榭啡笳吲c地衣酚（3，5-二羥基甲苯）反應(yīng)呈鮮綠色，該反應(yīng)需用三氯化鐵或氯化銅作催化劑。（3）磷酸與鉬酸銨試劑作用產(chǎn)生黃色的磷鉬酸銨沉淀[(NH4)3PO4·12MoO3↓]。二、實(shí)驗(yàn)原理三、儀器、原料和試劑儀器：試管；試管架；100mL氫氧化鈉燒杯；移液管0.2mL（×1）、2.0mL（×2）、1mL（×2）；量筒10mL、50mL各一個(gè)；滴管；水浴

4、鍋；離心機(jī)；布氏漏斗。原料：干酵母粉三、儀器、原料和試劑試劑：（1）0.2%氫氧化鈉溶液；（2）95%乙醇；（3）乙酸、乙醚；（4）10%硫酸；（5）0.1mol/L硝酸銀溶液；（6）1mol/L濃氨水；（7）酸性乙醇溶液：30mL乙醇加0.3mLHCl；（8）三氯化鐵-濃鹽酸溶液：將2mL10％三氯化鐵（FeCl3·6H2O）溶液加入400mL濃HCl中；（9）地衣酚-乙醇溶液：稱取6g地衣酚溶于100mL95％乙醇；（10）鉬酸銨試劑：將2g鉬酸銨溶解在100mL10%硫酸中。四、實(shí)驗(yàn)步驟1、酵母RNA的提取稱4g干酵母粉懸浮于40mL0.2%

5、NaOH溶液中并在研缽中研磨均勻。懸浮液轉(zhuǎn)入100mL燒杯中沸水浴加熱30分鐘，不斷攪拌。冷卻，3000r/min離心10-15分鐘后，將上清液慢慢傾入10mL酸性乙醇，邊加邊攪。加畢，靜置，待RNA完全沉淀，3000r/min離心3min。棄去上清，用95%乙醇洗滌沉淀兩次（每次約10ml），繼而用無水乙醚洗兩次（每次10ml），洗滌時(shí)可用細(xì)玻璃棒小心攪動(dòng)沉淀。用乙醚將沉淀轉(zhuǎn)移至布氏漏斗抽濾，沉淀在空氣中干燥。稱量所得RNA粗品的重量。2．RNA組分鑒定水解RNA：取0.5~1g提取的核酸，加入10%硫酸10mL沸水浴加熱10分鐘制成水解液，然后

6、進(jìn)行組份鑒定。（1）嘌呤堿：取一支試管，加入1mL水解液，加入過量濃氨水（約2mL）。然后加入1mL0.1M硝酸銀溶液，觀察有無嘌呤堿銀化合物沉淀。（2）核糖：取一支試管，加入水解液1mL，三氯化鐵濃鹽酸溶液2mL和地衣酚乙醇溶液0.2mL。放沸水浴中10min。注意觀察核糖是否變成綠色。（3）磷酸：取一支試管，加入2mL水解液，然后加入5滴硝酸銀和1mL鉬酸銨溶液后，在沸水浴中加熱，觀察有無黃色磷鉬酸銨沉淀。五、計(jì)算RNA提取率（%）=RNA質(zhì)量（g）/干酵母粉質(zhì)量（g）×100%六、注意事項(xiàng)稀堿法提取的RNA為變性RNA，可用于RNA組分鑒定及

7、單核苷酸制備，不能作為RNA生物活性實(shí)驗(yàn)材料。利用等電點(diǎn)控制RNA析出時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格控制pH。地衣酚反應(yīng)特異性較差，凡戊糖均有此反應(yīng)。因此地衣酚實(shí)驗(yàn)不能作為RNA與DNA鑒別的依據(jù)。七、思考題1、如何得到高產(chǎn)量RNA的粗制品？2、現(xiàn)有三瓶未知溶液，已知它們分別為蛋白質(zhì)、糖和RNA，采用什么試劑和方法鑒定？（自行設(shè)計(jì)簡便的實(shí)驗(yàn)）