《電泳技術(shù)復(fù)》PPT課件

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1、電泳技術(shù)劉松財2011本章的主要內(nèi)容電泳技術(shù)的應(yīng)用電泳概念電泳分類電泳原理一、概念電泳（Electrophoresis）：在直流電場中，帶電粒子向帶符號相反的電極移動的現(xiàn)象稱為電泳。二、電泳分類電泳法可分為自由電泳（無支持體）及區(qū)帶電泳（有支持體）兩大類。自由電泳法的發(fā)展并不迅速，因為其電泳儀構(gòu)造復(fù)雜、體積龐大，操作要求嚴(yán)格，價格昂貴等。而區(qū)帶電泳可用各種類型的物質(zhì)作支持體，其應(yīng)用比較廣泛。區(qū)帶電泳的分類如下：1．按支持物物理性狀不同，可分為：(1)濾紙及其他纖維素膜如乙酸纖維膜、玻璃纖維膜、聚胺纖維膜電泳。(2)粉末電泳，如纖維素粉、淀粉、玻璃粉電泳

2、。(3)凝膠電泳，如瓊脂糖、瓊脂、硅膠、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠電泳。(4)絲線電泳，如尼龍絲、人造絲電泳。2．按支持物的裝置形式不同，可分為：(1)平板式電泳，支持物水平放置，是最常用的電泳方式。(2)垂直板式電泳。3．按pH的連續(xù)性不同，可分為：(1)連續(xù)pH電泳：電泳的全部過程中緩沖液pH保持不變。如紙電泳、乙酸纖維膜電泳。(2)非(不)連續(xù)pH電泳：緩沖液與支持物之間有不同的pH，如聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳、等電聚焦電泳、等速電泳等，能使分離物質(zhì)的區(qū)帶更加清晰，并可作ng級微量物質(zhì)的分離。三、電泳的基本原理電泳(Electrophoresis)是指

3、帶電荷的膠體粒子在電場作用下的定向移動現(xiàn)象。氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)和核酸等具有可解離基團，在溶液中能夠形成帶電荷的離子，不同物質(zhì)由于帶電性質(zhì)不同，因而在一定電場強度下移動速度不同。不同的帶電顆粒在同一電場中的泳動速度不同，常用遷移率或泳動速度表示。遷移率的定義為帶電顆粒在單位電場強度下的泳動速度。式中：m為遷移率(厘米/伏特·秒)；v為顆粒的泳動速度(厘米/秒)；E為電場強度(伏特/米)；d為顆粒泳動的距離(厘米)；l為支持物的有效長度(厘米)，即載體與兩極溶液交界面間的距離；V為實際電壓(伏特)；t為通電時間(秒)。通過測量d、l、V，t便可計算出顆粒

4、的遷移率。帶電顆粒在電場中的泳動速度與本身所帶凈電荷的量，顆粒大小和形狀有關(guān)。一般說來，所帶凈電荷量愈多，顆粒愈小，愈接近球形，則在電場中的泳動速度愈快，反之則愈慢。泳動速度除了受顆粒本身性質(zhì)的影響外，還和其它外界因素有關(guān)，它們之間的相互關(guān)系可用下式表示：由上式可以看出泳動速度與電動電勢(Z)、電場強度(E)及介質(zhì)的介電常數(shù)(D)成正比，與溶液的粘度成（Cn）反比。式中C為一個常數(shù)，其數(shù)值為4～9π，由顆粒大小所決定。在正常情況下進(jìn)行電泳時，膠體粘度，介電常數(shù)及電勢梯度都在同一條件下，故膠體分子大小及其所帶電荷多少，決定其泳動速度。由于樣品中各種蛋白質(zhì)

5、的分子量不同，等電點不同，所帶電荷多少亦不相同，在一定條件下各種蛋白質(zhì)的泳動速度(遷移率)各異。影響遷移率的因素有如下幾個方面：1.樣品帶電顆粒本身的性質(zhì)在幾個方面影響著它的遷移率(1)電荷：遷移率隨著帶電顆粒凈電荷的增加而增加，電荷量的大小一般由pH決定。(2)大?。簩τ谳^大的分子，由于周圍介質(zhì)所引起的摩擦力和靜電引力的增加，遷移率下降。(3)形狀同樣大小，但具有不同形狀的分子，如纖維狀蛋白質(zhì)和球狀蛋白質(zhì)，因摩擦力和靜電引力的不同，而表現(xiàn)出不同的遷移率。2.電場根據(jù)實驗的需要，電泳可分為兩種，一種是常壓電泳，電壓在500伏特以下，分離時間較長。另一種

6、是高壓電泳，電壓為1000伏特以上，電泳時間很短，有時僅需數(shù)分鐘。常壓電泳多用于分離蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)；高壓電泳則多用來分離氨基酸、多肽、核苷酸、糖類等小分子物質(zhì)。歐姆定律表示了電流(A)、電壓(V)和電阻(Ω)之間的關(guān)系：A＝v/Ω(1)電流遷移率與電流成正比。帶電顆粒遷移的距離與通電時間也成正比。電泳時必須保持電流的恒定。(2)電壓電壓控制著電流，因此遷移率與加在支持介質(zhì)兩端的電位差(端電壓)成正比。(3)電阻遷移率與電阻成反比3.緩沖液(1)成分(2)pH溶液的pH值決定帶電顆粒解離的程度，亦即決定其所帶凈電荷的多少。(3)離子強度一般最適的

7、離子強度在0.02～0.2之間4.電滲電泳時，濾紙、醋酸纖維素薄膜等支持物在緩沖液中都帶有負(fù)電荷，而與這些支持物接觸的水溶液則帶正電荷(靜電吸引)。電泳時，由于濾紙、醋纖膜等固定不動，于是帶正電荷的水就流向負(fù)極，并攜帶顆粒也—起向負(fù)極移動。由于電滲現(xiàn)象與電泳作用同時存在，當(dāng)電泳方向與電滲方向—致時，其蛋白遷移的距離等于兩者相加之和；若兩者方向相反時，則顆粒的泳動距離為電泳的距離減去電滲的距離。凝膠電泳的支持介質(zhì)：固體支持介質(zhì)可以分兩類：一類是紙、醋酸纖維素薄膜、硅膠、纖維素等。這些介質(zhì)相對來說是化學(xué)惰性的，能將對流減到最小。另一類是淀粉、瓊脂糖和聚丙酰

8、胺凝膠。這些凝膠介質(zhì)不僅能防止對流，擴散最小，而且它們是多孔介質(zhì)，孔徑大小與生物大分子具有相似