高效液相色譜法測定黃酮

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1、高效液相色譜法測定金線蓮中黃酮含量金線蓮為蘭科(Orchidaceae)開唇蘭屬(Anoec-tochilus)珍稀瀕危藥用植物,主產(chǎn)于我國福建、臺灣和云南等省，其中福建金線蓮[Anoectochilusroxburghii(Wall.)Lindl.]為主要藥用種之-一川。該植物主要用于治療高血壓、糖尿病、肝炎、腎炎等癥,療效獨特2),素有“藥王”、“金草”之稱。目前野生金線蓮日漸匱乏,且市場較為混亂，急切需要科學(xué)的方法對金線蓮藥用種加以甄別。本文在對福建金線蓮系統(tǒng)的化學(xué)研究結(jié)果基礎(chǔ)上,對其主要成分黃酮進行定性及定量分析，并比較了同為開唇蘭屬,而未作為金線蓮主要藥用

2、種的云南金線蓮(AnoectochilusburmannicusRolfe)與福建金線蓮黃酮苷元類型和含量的差異,從而為金線蓮的種間鑒別、人工栽培等研究提供依據(jù)。福建金線蓮化學(xué)成分研究的結(jié)果表明,該植物中富含黃酮類化合物,結(jié)構(gòu)以異鼠李素、槲皮素及山柰素型黃酮醇苷為主[2-4]。而總黃酮含量以及3種主要類型黃酮含量之比是金線蓮質(zhì)量控制的重要指標，因此有必要建立金線蓮中黃酮類化合物的含量測定方法，為金線蓮種的鑒別以及人工栽培方法等研究奠定化學(xué)基礎(chǔ)。總黃酮含量測定通常使用紫外分光光度法及高效液相色譜法,后者選擇性優(yōu)于前者。本文對金線蓮乙醇提取物進行酸水解處理，采用高效液相

3、色譜法測定其水解所得主要苷元:異鼠李素槲皮素和山柰索的含量,計算3種黃酮苷元總含量及其比例，對比福建金線蓮與云南金線蓮之間黃酮類化學(xué)成分的差別。1儀器、試劑與材料美國Waters公司高效液相色譜儀:Waters600控制器,616泵,996二極管陣列檢測器,2010工作站。對照品:槲皮素、異鼠李素為本室自制,純度95%以，上(以NMR和MS鑒定結(jié)構(gòu)，以HPLC一ELSD鑒定純度)。甲醇(色譜純):天津四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司;乙腈(色譜純):MerckKGaA，F(xiàn)ish-ierChemAlert;95%乙醇(分析純):北京化工廠;85%磷酸(分析純)福建金線蓮(An

4、oectochilusroxburghii)與云南金線蓮(Anoectochilusburmannicus)干燥藥材均由郭順星研究員提供并鑒定。藥材自然干燥后粉碎,過40目篩作為待測樣品。2色譜條件色譜柱:Waters公司SymmetryCg(5μm,3.9mmx150mm);Waters公司SymmetryC18預(yù)柱;流動相:乙腈-0.03%磷酸水溶液(24:76)，流速:1.0mL。min,檢測波長:370nm,柱溫:35C。3.溶液制備3.1對照品混合溶液精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥過夜的對照品槲皮素、異鼠李索適量,分別加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，分別取

5、此2種溶液均為0.1,0.5,1.0,2.0,3.0,5.0mL,置于同一10mL量瓶中,配制槲皮素和異鼠李素濃度分別為5.900,5.005μg。mL-;29.50,25.02μg°mL~;59.00,50.05μg，mL~';118.0,100.1μg。mL~';168.0,150.2μg，mL-';295.0,250.2μg。mL~'的對照品混合溶液。3.2供試品溶液取藥材粉末0.5g,加95%乙醇6mL浸泡過夜，回流提取3次(6,6,6mL),每次1.5h,提取溶液轉(zhuǎn)人25mL量瓶中，加95%乙醇至刻度,搖勻，取此溶液5mL,加甲醇-25%鹽酸水溶液(4:1

6、)12.5mL水解1h。水解物回收溶劑至干，加95%乙醇適量溶解，置于25mL量瓶中，加95%乙醇至刻度,搖勻。0.45μm濾膜過濾,取續(xù)濾液作為供試品溶液。4方法學(xué)考察4.1線性關(guān)系考察精密量取“3.1”項下不同濃度的對照品混合溶液各20μL分別進樣，以進樣量(μg)與峰面積積分值進行線性回歸。得到槲皮素和異鼠李素的線性回歸方程以及相關(guān)系數(shù)分別為:m=4.5x10~A+0.052r=0.9998m=4.8x10~'A+0.026r=0.99964.2精密度試驗按上述色譜條件,分別精密量取槲皮素和異鼠李素濃度分別為59.00,50.05μg，mL-'的對照品混合溶液

7、,連續(xù)進樣6次，每次進樣20μL,測定各成分的峰面積，計算得槲皮素.異鼠李素的RSD分別為1.3%和1.4%。4.3重復(fù)性試驗按照“3.2”項下方法制備供試品溶液5份,精密量取20μL進樣,測量峰面積,計算槲皮素、山柰素和素異鼠李素3種苷元含量分別為0.032%,0.008%,0.046%;RSD分別為3.5%，1.6%,1.8%。重復(fù)性良好。4.4加樣回收率試驗精密稱取福建金線蓮約0.5g,加95%乙醇6mL,加人槲皮素濃度為0.1180mg，mL~'、異鼠李素濃度為0.1011mg.mL-的對照品混合溶液50μL。按照“3.2”項下方法制備供試溶液，重復(fù)操作