高速逆流色譜操作

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1、高速逆流色譜操作步驟和要點操作步驟：?1?配液。超聲脫氣約20min，脫氣后靜置冷卻至室溫后泵液。?2?打開恒溫水浴，將溫度升至設(shè)定溫度。?3?泵固定相。以10-20mL/min流速泵入固定相，檢測器出口端流出固定相約20-50?mL后停泵。?4?平衡。打開紫外檢測器開始預(yù)熱，正轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)動主機至900?rpm（FWD為正轉(zhuǎn)，REV為反轉(zhuǎn)），同時以3?mL/min流速泵入流動相，至出口端流出流動相且此時紫外信號穩(wěn)定，體系基本己平衡。?5?進樣。以體系的上、下相溶解一定量的樣品，超聲溶解均勻后，在裝樣注射器中倒入樣品溶液，將進樣六通問切換至

2、load，推排氣泡后吸液至樣品全進入進樣圈中，將load切換至inject，檢測器、工作站調(diào)零開始記錄。?6?接收流分。工作站記錄，設(shè)備運行時間為如5?min，保存后采集數(shù)據(jù)，保存。?7清洗。斷開泵與主機的連接，將主機進口與氣管出口連接，吹氣；將主機中溶劑吹出后，泵入約50?mL清洗液，吹氣，重復(fù)此過程2~3次；最后一次長時間（1小時左右直至吹干）吹氣時將主機內(nèi)液體吹盡。?8?關(guān)機。??操作要點：?本儀器適用于有機溶劑，316L不銹鋼及PTFE材料可耐受的酸堿溶液。?1?本設(shè)備可承受的壓力限制為2?MPa，請勿泵入不可溶解的固體顆粒

3、。?2?設(shè)備運行前先檢查連接管路是否正確，是否緊密；檢測器波長是否正確。?3?配液時溶劑應(yīng)混合均勻，自然分層澄清后可超聲脫氣，脫氣時間不宜過長，脫氣后如溶劑有溫?zé)釀t最好冷卻靜置至室溫后使用。?4?樣品溶解可為體系上相或下相，或同時兩相溶解；不可以單一的溶劑來溶解進樣，以免破壞主機內(nèi)的體系平衡。?5?每次做完實驗請及時清洗設(shè)備，一般清洗液為甲醇、乙醇等，如體系內(nèi)含有酸、堿、鹽等溶劑，建議先以純凈水清洗l~2次后，再以清洗液清洗。?6?日常清洗完設(shè)備后；如需繼續(xù)進行實驗，請設(shè)備放置2小時后重新平衡。?7?操作中如有氣泡、流失或其他異?，F(xiàn)

4、象，可致電上海同田生物技術(shù)有限公司技術(shù)支持部?2?附件1：儀器性能檢驗?苯酚、間苯二酚的分離?體系：正已烷：乙酸乙酯：乙醇：水=1：1：1.2：0.8??把溶劑按比例配制好，混合均勻后分相，上相用作固定相，下相用作流動相，分別超聲脫氣約20?min。?樣品為苯酚、間苯二酚，各30?mg溶于5?mL上下混合溶劑中?1、主機分離管路體積的測定?用量筒取500毫升上相，用泵泵入主機管路內(nèi)，當(dāng)上相從管路的出柱口流出后，繼續(xù)泵至上相流出30毫升，停泵，記錄下量筒內(nèi)剩下的上相體積，及收集到的流出上相的體積；?總體積的計算：?V總=500-V剩余

5、-V流出?………………………………………..（1）?????????式中：?V總——管路測定總體積（mL）；???????V剩余------泵入固定相的體積后，剩余在量筒中的體積（mL）；??????????V流出------流出固定相的體積（mL）。?2、固定相保留率的測定?以900?rpm的轉(zhuǎn)速正向旋轉(zhuǎn)已被上相充滿管路的主機，同時以3.00?mL/min的流速往分離管路內(nèi)泵入流動相，當(dāng)主機出柱口管路流出流動相后，量出被流動相推出的上相體積（V出）；?固定相保留率的計算：?????????保留率=????????????×100%

6、……………………………………(2)?式中：V總――管路總體積（mL）?V出――流動相推出上相體積（mL）?V環(huán)――進樣環(huán)的體積（mL）?保留率大于等于40%為合格。?3、標準峰的驗證?通過六通閥往上、下相已經(jīng)平衡了的管路內(nèi)加入溶解好的樣品，用流動相以3.00?mL/min流速洗脫，直至標準峰的出現(xiàn)，整個過程須用色譜工作站記錄譜圖。TBE-300A高速逆流色譜儀說明書高速逆流色譜（high-speed?countercurrent?chromatography，HSCCC）是20世紀80年代發(fā)展起來的一種連續(xù)高效的液－液分配色譜分離技

7、術(shù)。它利用兩相溶劑體系在高速旋轉(zhuǎn)的螺旋管內(nèi)建立的一種特殊的單向性流體動力學(xué)平衡，當(dāng)其中一相作為固定相，另一相作為流動相，在連續(xù)洗脫的過程中能保留大量固定相。由于不需要固體支撐體，物質(zhì)的分離依據(jù)其在兩相中分配系數(shù)的不同而實現(xiàn)，因而避免了因不可逆吸附而引起的樣品損失、失活、變性等，目前已廣泛應(yīng)用于多種領(lǐng)域。?HSCCC的應(yīng)用領(lǐng)域：?1、天然產(chǎn)物有效成分的分離純化;?2、多肽，蛋白質(zhì)和多糖等生物大分子分離?3、抗生素的分離純化?4、化工和化學(xué)合成物質(zhì)的分離純化?5、食品功能成分的分離純化?6、農(nóng)藥殘留物質(zhì)分離分析?7、中藥指紋圖譜和質(zhì)量控

8、制研究?8、海洋生物活性成分的分離純化?HSCCC的獨特優(yōu)勢：?1、高效提純；?2、大制備量；?3、低使用成本；?4、高科研價值；?5、易工藝放大；?6、高回收率。??1、系統(tǒng)構(gòu)成：?由TBE-300A型高速逆流色譜分離儀組成的分離分