激光共焦顯微鏡技術(shù)

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1、激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)及應(yīng)用ThetechniquesandapplicationofConfocalLaserScanningMicroscopy激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)樣品要求原理功能在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)人眼分辨率：0.2mm光學(xué)顯微鏡分辨率：0.25mm電子顯微鏡分辨率：0.2nm共焦顯微鏡分辨率：0.18mm二、原理激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)原理小結(jié):Confocal利用放置在光源后的照明針孔和放置在檢測(cè)器前的探測(cè)針孔實(shí)現(xiàn)點(diǎn)照明和點(diǎn)探測(cè)，來自光源的光通過照明針孔發(fā)射出的光聚焦在樣品焦平面的某個(gè)點(diǎn)上，該點(diǎn)所發(fā)射的熒光成像在

2、探測(cè)針孔上，該點(diǎn)以外的任何發(fā)射光均被探測(cè)針孔阻擋。照明針孔與探測(cè)針孔對(duì)被照射點(diǎn)或被探測(cè)點(diǎn)來說是共軛的，因此被探測(cè)點(diǎn)即共焦點(diǎn)，被探測(cè)點(diǎn)所在的平面即共焦平面。計(jì)算機(jī)以像點(diǎn)的方式將被探測(cè)點(diǎn)顯示在計(jì)算機(jī)屏幕上，為了產(chǎn)生一幅完整的圖像，由光路中的掃描系統(tǒng)在樣品焦平面上掃描，從而產(chǎn)生一幅完整的共焦圖像。只要載物臺(tái)沿著Z軸上下移動(dòng)，將樣品新的一個(gè)層面移動(dòng)到共焦平面上，樣品的新層面又成像在顯示器上，隨著Z軸的不斷移動(dòng)，就可得到樣品不同層面連續(xù)的光切圖像。激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯

3、微鏡的區(qū)別1.抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別2.具有更高的軸向分辨率，并可獲取連續(xù)光學(xué)切片conventionalconfocal激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別3.增加側(cè)向分辨率激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別4.由于點(diǎn)對(duì)點(diǎn)掃描去除了雜散光的影響激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)三.激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計(jì)特點(diǎn):1.點(diǎn)照明2.具有照明pinhole和探測(cè)pinhole3.照明pinhole和探測(cè)pinhole共軛(共焦),共焦點(diǎn)即被探測(cè)點(diǎn)，被探測(cè)點(diǎn)所在的平面為共焦平面

4、4.具有掃描系統(tǒng)——逐點(diǎn)掃描成像5.具有多個(gè)（四個(gè)）熒光通道，可同時(shí)探測(cè)多個(gè)被標(biāo)記物激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)技術(shù)指標(biāo)（LeicaTCSSP2):1.xy分辨率比傳統(tǒng)顯微鏡小1.4x傳統(tǒng)顯微鏡:Rxy=0.61?/NA（0.25?m)Confocal:Rxy=0.4?/NA（0.18?m)2.樣品的最大厚度:取決于:物鏡的NA、物鏡的工作距離激光的穿透力、樣品的透明度Z軸的最大移動(dòng)范圍(166?m、Z-wide)3.樣品的最小光切厚度:(載物臺(tái)最小移動(dòng)距離為40nm）取決于:物鏡的NA、針孔大小Z軸的最小移動(dòng)步距:40nmZ軸的分辨率:0.35?

5、m激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)4.激光器Ar激光器:458nm,476nm,488nm,514nmGreNe:543nm;HeNe:633nmAr激光器(UV):361nm激光器的特點(diǎn):1)方向性好:激光基本延直線傳播2)單色性好:??=10-8nm3)高亮度:激光方向性好,其在空間上的能量分布是高度集中的。4)偏振性:激光為平面偏振光,光纖耦合激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)5.四個(gè)熒光通道,一個(gè)透射光通道即除了可同時(shí)采集多標(biāo)記熒光圖像外還可以同時(shí)采集透射光圖像,但透射光圖像為非共焦圖像。激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)6.掃描速度:slow220lines/s51

6、2?5122-3秒slow2440lines/s（2：雙向掃描）medium450lines/s512?5121.7秒medium2900lines/sfast1000lines/s512?5120.7秒128?1280.2秒fast22000lines/s7.掃描密度:64?64128?128512?5121024?10242048?2048激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)的應(yīng)用TheapplicationofConfocalLaserScanningMicroscopy激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用功能.1.多熒光標(biāo)記樣品的高清晰度、高分辨率圖像采集2.

7、無損傷、連續(xù)光學(xué)切片，顯微“CT”3.真正的三維重組4.假三維圖的顯示5.可沿Z軸（xy平面）和Y軸（xz平面）方向進(jìn)行光切6.定量分析7.時(shí)間序列掃描:xyt、xyzt和xt掃描8.圖像處理9.旋轉(zhuǎn)掃描10.感興趣區(qū)域掃描11.光譜掃描激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用應(yīng)用定位、定量三維重組動(dòng)態(tài)測(cè)量?活細(xì)胞或組織內(nèi)游離Ca2+分布和濃度的變化測(cè)量(Mg2+、Zn+、Na+、K+)?自由基的檢測(cè)?藥物進(jìn)入細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過程、定位分布及定量?蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)位激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用活細(xì)胞內(nèi)H+濃度（pH值）的測(cè)量線粒體膜電位的測(cè)量熒光漂白恢復(fù)（FRAP）的測(cè)量籠鎖解

8、籠鎖的測(cè)量熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）的測(cè)量其他應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用一、定位、定量免疫熒光標(biāo)記（單標(biāo)、雙標(biāo)或三標(biāo)）的定位、定量：如：細(xì)胞膜受體或抗原的分布，微