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1、WesternBlot實驗操作指南WesternBlot即蛋白質印跡法（免疫印跡試驗），是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品中的特定蛋白進行顯影。通過分析顯影的位置和顯影深度獲得特定蛋白質在所分析的細胞或組織中表達情況的信息。實驗流程主要包括以下幾個步驟：樣品制備；SDS-PAGE凝膠電泳；轉膜；封閉；免疫雜交；顯影。實驗器材操作步驟樣品制備準備進行westernblot的樣品可分為細胞、組織、免疫沉淀或親和純化后的蛋白等。樣品為蛋白溶液時不需要進行提取，而樣品為細胞
2、、組織或包埋組織等則需要根據樣品的特性對其進行提取。根據需求不同還可針對于細胞亞結構進行提取。（1）以體外培養(yǎng)的貼壁細胞樣本為例，對其進行總蛋白提?。?、倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或將瓶直立放置一會兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。2、每瓶細胞加3ml4℃預冷的PBS（0.01MpH7.2～7.3）。平放輕輕搖動1min洗滌細胞，然后棄去洗液。重復以上操作兩次，共洗細胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。3、按1ml裂解液加10μlPMSF（100mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無結晶時
3、才可與裂解液混合。）4、每瓶細胞加400μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，為使細胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經常來回搖動。5、裂解完后，用干凈的刮棒將細胞刮于培養(yǎng)瓶的一側（動作要快），然后用槍將細胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中。（整個操作盡量在冰上進行。）6、于4℃下12000rpm離心5min。（提前開離心機預冷）7、將離心后的上清分裝轉移倒0.5min的離心管中放于－20℃保存。（2）以哺乳動物組織樣本為例，對其進行總蛋白提?。?.將100mg組織剪切成小塊，加入適量的冰冷PBS洗滌兩次后，4℃，700×g（3000rpm)離心3min
4、，棄上清。20mg組織加入100μl裂解液，置玻璃勻漿器冰上均質30～50次。(如使用組織勻漿機，則按照20mg組織加入100μl裂解液的比例加入裂解液。每個試管加入2個直徑2mm的磁珠。將試管放入組織勻漿機中，60HZ，300s。充分裂解后，10000g離心5min，取上清。)2.最大速度渦旋震蕩10sec，冰上放置20min，期間取出震蕩3-5次,再于4℃，12000rpm離心10min，以沉淀組織或細胞碎片，取上清。生工相關產品：產品編號產品名稱產品編號產品名稱C500005、細胞核蛋白/漿蛋C510006、C510001RIPA裂解液I~I
5、V白抽提試劑盒C500007、C500008膜蛋白、核蛋白和動物全蛋白提取試C510002胞質蛋白抽提試劑C510003劑盒盒膜蛋白和胞質蛋白石蠟包埋組織蛋白C510005C500058提取試劑盒提取試劑盒細胞核蛋白質提取C500009C500049膜蛋白提取試劑盒試劑盒胞質和線粒體蛋白亞細胞結構蛋白提C500051C500073質提取試劑盒取試劑盒植物蛋白提取試劑一步法昆蟲細胞活C500053C510020盒性蛋白提取試劑盒一步法植物活性蛋一步法細菌活性蛋C510004C500023白質提取試劑盒白提取試劑盒一步法動物組織活一步法酵母活性蛋C50
6、0006C500026性蛋白提取試劑盒白提取試劑盒一步法動物細胞活C500022性蛋白提取試劑盒蛋白定量蛋白定量是做WB實驗的基礎。蛋白定量的目的是：保證同一組中的不同樣本的蛋白總量保持一致，只有這樣，wb結果的內參、灰度等數據才可信。否則實驗數據沒有參考價值。蛋白定量的方法很多，常用的有Lowry法、BCA法、紫外吸收法、Biuret法、這些方法各有優(yōu)缺點。應該按照具體實驗選擇不同的實驗方法進行蛋白定量。示例：BCA法蛋白定量1.根據樣品數量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B(50:1)配制適量BCA工作液，充分混勻。BCA工作液室溫2
7、4小時內穩(wěn)定。2.完全溶解蛋白標準品，取10ul稀釋至100ul，使終濃度為0.5mg/ml。蛋白樣品在什么溶液中，標準品也宜用什么溶液稀釋。但是為了簡便起見，也可以用0.9%NaCl或PBS稀釋標準品。3.將標準品按0,1,2,4,8,12,16,20ul加到96孔板的標準品孔中，加用于稀釋標準品的溶液補足到20ul。4.加適當體積樣品到96孔板的樣品孔中，加用于稀釋標準品的溶液至20ul。5.各孔加入200ulBCA工作液，37℃放置30分鐘。注:也可以室溫放置2小時，或60℃放置30分鐘。BCA法測定蛋白濃度時，吸光度會隨著時間的延長不斷加深
8、。并且顯影反應會因溫度升高而加快。如果濃度較低，適合在較高溫度孵育，或延長孵育時間。6.測定A562，540-595nm之
