WB實(shí)驗(yàn)步驟

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1、提取細(xì)胞或組織蛋白、測(cè)定大致含量↓制備SDS-PAGE膠↓蛋白樣品變性、電泳↓電泳轉(zhuǎn)膜↓封閉↓一抗↓TBST洗滌↓HRP標(biāo)記的二抗BST洗滌↓ECL試劑作用↓X-光片曝光、顯影↓結(jié)果分析[主要試劑]1、SDS-PAGE試劑：2、勻漿緩沖液：1.0MTris-HCl(pH6.8)1.Oml；10%SDS6.0ml；β-巰基乙醇0.2ml；ddH2O2.8ml。3、轉(zhuǎn)膜緩沖液：甘氨酸2.9g；Tris5.8g；SDS0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。4、0.01MPBS(pH7.4)：Na

2、Cl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24g；加ddH2O至1000ml。5、膜染色液：考馬斯亮蘭0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118ml。包被液（5%脫脂奶粉，現(xiàn)配）：脫脂奶粉1.0g溶于20ml的0.01MPBS中。6、顯色液：DAB6.0mg；0.01MPBS10.0ml；硫酸鎳胺0.1ml；H2021.0μl。7、兔抗豬R蛋白抗體、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG（二抗）。[操作步驟]1、蛋白質(zhì)樣品獲得：細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)后，可通過(guò)電泳上樣緩沖液直接裂解細(xì)胞，真核細(xì)胞加勻

3、漿緩沖液，機(jī)械或超聲波室溫勻漿0.5-1min。然后4℃，13,000g離心15min。取上（1）電泳結(jié)束后將膠條割至合適大小，用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡，5min×3次。（2）膜處理：預(yù)先裁好與膠條同樣大小的濾紙和NC膜，浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中10min。（3）轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按陽(yáng)極碳板、24層濾紙、NC膜、凝膠、24層濾紙、陰極碳板的順序放好，濾紙、凝膠、NC膜精確對(duì)齊，每一步去除氣泡，上壓500g重物，將碳板上多余的液體吸干。接通電源,恒流1mA/cm2，轉(zhuǎn)移1.5hr。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，斷開(kāi)電源將膜取出,割取待測(cè)膜

4、條做免疫印跡。將有蛋白標(biāo)準(zhǔn)的條帶染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脫色，至背景清晰，然后用雙蒸水洗，風(fēng)干夾于兩層濾紙中保存，留與顯色結(jié)果作對(duì)比。4、免疫反應(yīng)：（1）用0.01MPBS洗膜，5min×3次。（2）加入包被液，平穩(wěn)搖動(dòng)，室溫2hr。（3）棄包被液，用0.01MPBS洗膜，5min×3次。置12hr以上。陰性對(duì)照，以1%BSA取代一抗，其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。（5）棄一抗和1%BSA，用0.01MPBS分別洗膜，5min×4次。（6）加入辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗（按合適稀釋比例用0.01MP

5、BS稀釋），平穩(wěn)搖動(dòng)，室溫2hr。（7）棄二抗，用0.01MPBS洗膜，5min×4次。（8）加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時(shí)放入雙蒸水中終止反應(yīng)。[注意事項(xiàng)]1、一抗、二抗的稀釋度、作用時(shí)間和溫度對(duì)不同的蛋白要經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳條件。2、顯色液必須新鮮配置使用，最后加入H2O2。3、DAB有致癌的潛在可能，操作時(shí)要小心仔細(xì)。技術(shù)服務(wù)流程：1.蛋白質(zhì)抽提o實(shí)驗(yàn)對(duì)象為組織樣品，取適量（250~500mg）新鮮組織樣品或正確保存的組勻漿后抽提總蛋白（或核蛋白）。o實(shí)驗(yàn)對(duì)象為細(xì)胞樣品，每份樣品取1×106～1×107細(xì)

6、胞，PBS清洗細(xì)胞，去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑）抽提總蛋白（或核蛋白）。2.蛋白質(zhì)定量：按BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說(shuō)明操作，測(cè)定樣品濃度。3.變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳(SDS-PAGE):將準(zhǔn)備好的樣品液和預(yù)染蛋白marker分別上樣，標(biāo)準(zhǔn)加進(jìn)第一個(gè)孔中，電泳分離蛋白。4.蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜,按Bio-Rad蛋白轉(zhuǎn)移裝置說(shuō)明組裝濾紙凝膠纖維素夾層，30mA恒流條件下，4°C轉(zhuǎn)移過(guò)夜。5.westernblot膜的封閉和抗體孵育膜在5％脫脂奶粉溶液中室溫孵

7、育1小時(shí)以封閉膜上的非特異結(jié)合。封閉過(guò)的膜加入一抗室溫孵育1.5小時(shí)，抗原抗體結(jié)合。加入HRP標(biāo)記的二抗體以結(jié)合一抗，室溫孵育膜1小時(shí)。加入HRP標(biāo)記的GAPDH抗體可同時(shí)檢測(cè)GAPDH含量。6.westernblot結(jié)果檢測(cè)：化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育，經(jīng)X膠片曝光顯影。圖片掃描保存為電腦文件，并用GIS1000分析軟件將圖片上每個(gè)特異條帶灰度值的數(shù)字化。7.westernblot數(shù)據(jù)分析：目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參GAPDF的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對(duì)含量。8.提供實(shí)驗(yàn)報(bào)告，包

8、括詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方法及免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)數(shù)據(jù)。westernblot費(fèi)用：每張膜上做一種目的蛋白和相應(yīng)的內(nèi)參蛋白。每張膜上可以做8個(gè)樣品。每張膜的費(fèi)用是：1500.00元。一抗另計(jì)，其它試劑免費(fèi)，一抗訂購(gòu)時(shí)間約為3周。WesternBlot相關(guān)試劑產(chǎn)品名稱包裝單價(jià)(RMB)Trypsin-EDTA0.25%,100ml150.00蛋白裂解液（蛋白提取液）10ml60.00