基因表達(dá)與蛋白質(zhì)純

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1、報(bào)告人曹雪美基因表達(dá)與蛋白質(zhì)純化技術(shù)探討讀書報(bào)告2010年9月30日主要內(nèi)容基因表達(dá)體系及優(yōu)劣勢大腸桿菌中表達(dá)蛋白質(zhì)及純化方法可能碰到的問題什么是基因表達(dá)呢？基因表達(dá)(geneexpression)是指儲存遺傳信息的基因經(jīng)過一系列步驟表現(xiàn)出其生物功能的整個(gè)過程。典型的基因表達(dá)是基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯，產(chǎn)生有生物活性的蛋白質(zhì)的過程?；虮磉_(dá)體系1.原核體系2.真核體系大腸桿菌(Escherichiacoli)E.coli是重要的原核表達(dá)體系。在重組基因轉(zhuǎn)化入E.coli菌株以后，通過溫度、誘導(dǎo)劑用量以及

2、誘導(dǎo)時(shí)間的控制，誘導(dǎo)其在宿主菌內(nèi)表達(dá)目的蛋白質(zhì)，將表達(dá)樣品進(jìn)行SDS-PAGE以檢測表達(dá)蛋白質(zhì)大腸桿菌(Escherichiacoli)遺傳背景清楚，基因工程操作方便，商品化表達(dá)載體種類齊全，表達(dá)效率高；基本不分泌蛋白，易形成包含體(無正確折疊的立體結(jié)構(gòu))，無加糖等修飾枯草桿菌(Bacillussubtilis)分泌蛋白質(zhì)能力強(qiáng)，一般有天然立體結(jié)構(gòu)；無加糖修飾功能，培養(yǎng)液中蛋白酶活性高，重組蛋白易受蛋白酶的水解；質(zhì)粒不穩(wěn)定，尚無商品化的表達(dá)載體其他乳酸菌(Lacticacidbacteria)沙門

3、氏菌(Salmonellatyphimurium)蘇云金桿菌(Bacillusthuringiensis)真核表達(dá)真核細(xì)胞表達(dá)體系酵母細(xì)胞昆蟲細(xì)胞哺乳動物細(xì)胞/組織植物細(xì)胞/組織酵母細(xì)胞可生產(chǎn)分泌型蛋白；有天然立體結(jié)構(gòu)，有加糖修飾功能；可進(jìn)行染色體整合型基因表達(dá);糖鏈與哺乳動物加工的不一致，培養(yǎng)上清多糖濃度高;商品化表達(dá)體系：釀酒酵母（Saccharomycecerevisiae）;畢氏酵母(Pichiapastoris);裂殖酵母（Schizosaccharomycepombe）昆蟲細(xì)胞可以病毒

4、感染的型式在成蟲中生產(chǎn)，也可在體外培養(yǎng)細(xì)胞中生產(chǎn)蛋白;適合分泌型和膜蛋白的表達(dá)，有加糖修飾；糖鏈有所區(qū)別，表達(dá)量有限；作為藥物宿主細(xì)胞未被FDA認(rèn)可CHO細(xì)胞可進(jìn)行分泌表達(dá)，有天然立體結(jié)構(gòu)，加糖方式與人體蛋白質(zhì)完全一致；表達(dá)量不夠高，培養(yǎng)成本較高植物組織植物可大面積種植，可以廉價(jià)大規(guī)模生產(chǎn)；轉(zhuǎn)基因植物制作費(fèi)時(shí)，表達(dá)的組織特異性較難控制；表達(dá)量較難提高，分離純化不方便動物乳腺組織分泌生產(chǎn)有天然立體結(jié)構(gòu)和活性的蛋白質(zhì)至乳汁，產(chǎn)量高，分離純化方便，特別適合藥用蛋白的生產(chǎn)；轉(zhuǎn)基因動物制作花費(fèi)巨大，實(shí)驗(yàn)周期

5、長原核表達(dá)與真核表達(dá)的區(qū)別1、載體的區(qū)別---整合機(jī)制2、表達(dá)產(chǎn)物的區(qū)別---蛋白修飾的程度區(qū)別表達(dá)類型載體載體舉例產(chǎn)物原核表達(dá)一般簡單，質(zhì)粒不整合到大腸桿菌的DNA而是自己復(fù)制表達(dá)pET系列產(chǎn)物一級結(jié)構(gòu)正確，但折疊不一定正確，沒有糖基化和磷酸化等修飾真核表達(dá)一般由宿主細(xì)胞匹配的整合機(jī)制的載體整合載體在基因組上表達(dá)酵母Y系列產(chǎn)物一般修飾的比較好，糖基化等完全，更接近天然蛋白體系選擇研究基因功能:大腸桿菌,裂殖酵母,昆蟲細(xì)胞,CHO細(xì)胞多肽藥物生產(chǎn):大腸桿菌,畢氏酵母,CHO細(xì)胞,乳腺組織疫苗:大腸

6、桿菌,酵母,大多數(shù)沿用細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物進(jìn)行滅毒單抗生產(chǎn):雜交瘤細(xì)胞工業(yè)酶生產(chǎn):各種微生物在大腸桿菌中表達(dá)外源基因獲得目的基因→準(zhǔn)備表達(dá)載體→將目的基因插入表達(dá)載體中（測序驗(yàn)證）→轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌→誘導(dǎo)靶蛋白的表達(dá)→表達(dá)蛋白的分析→擴(kuò)增、純化、進(jìn)一步檢測原核表達(dá)一般程序（一）獲得目的基因1、通過PCR方法：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設(shè)計(jì)一對引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn)），PCR循環(huán)獲得所需基因片段。2、通過RT-PCR方法：用TRIzol法從細(xì)胞或組織中提取總RNA，以mRN

7、A為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。原核表達(dá)操作步驟（二）構(gòu)建重組表達(dá)載體1、載體酶切：將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶（同引物的酶切位點(diǎn)）進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。2、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體。1、將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，根據(jù)重組載體的標(biāo)志（抗Amp或藍(lán)白斑）作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。2、測序驗(yàn)證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確，進(jìn)入下步操作

8、。否則應(yīng)篩選更多克隆，重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點(diǎn)。3、以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。（三）獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種1、挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2mlLB（含Amp50μg/ml）中37℃過夜培養(yǎng)。2、按1∶50比例稀釋過夜菌，一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600≌0.4-1.0（最好0.6，大約需3hr）。3、取部分液體作為未誘導(dǎo)的對照組，余下的加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.4mM作為實(shí)驗(yàn)組，兩組繼續(xù)3