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《NEB常用酶介紹》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、DpnI識(shí)別位點(diǎn)在不同反應(yīng)緩沖液的活性NEBuffer1.1:100%NEBuffer2.1:100%NEBuffer3.1:75%CutSmartBuffer:100%來源重組E.coli菌株，包含有從DiplococcuspneumoniaeG41(S.Lacks)克隆的DpnI基因。特性CutSmart、重組酶、省時(shí)酶。連接和再切經(jīng)過DpnI20倍過量消化，大約25%的DNA片段能被連接，連接片段中>95%能被再切。反應(yīng)條件CutSmart緩沖液，37℃。熱失活：80℃20分鐘。濃度20,000units
2、/ml?！就ㄟ^pBR322DNA（dam甲基化后）鑒定】。甲基化敏感性只有當(dāng)識(shí)別位點(diǎn)被甲基化時(shí)，DpnI才能切割。從dam+菌株純化而來的DNA才是DpnI切割的底物。對(duì)哺乳動(dòng)物基因組DNACpG甲基化敏感。NcoI識(shí)別位點(diǎn)在不同反應(yīng)緩沖液的活性NEBuffer1.1:100%NEBuffer2.1:100%NEBuffer3.1:100%CutSmartBuffer:100%特性重組酶、省時(shí)酶。反應(yīng)條件NEBuffer3.1，37℃。熱失活：80℃20分鐘。濃度10,000和50,000units/ml。甲基
3、化敏感性對(duì)dam、dcm和哺乳動(dòng)物CpG甲基化均不敏感。NotI識(shí)別位點(diǎn)在不同反應(yīng)緩沖液的活性NEBuffer1.1:<10%NEBuffer2.1:50%NEBuffer3.1:100%CutSmartBuffer:25%特性重組酶、省時(shí)酶。反應(yīng)條件NEBuffer3.1，37℃。熱失活：65℃20分鐘。濃度10,000和50,000units/ml。甲基化敏感性對(duì)哺乳動(dòng)物基因組DNACpG甲基化敏感。注意事項(xiàng)徹底消化超螺旋質(zhì)粒需要的NotI酶量為消化線性DNA的5倍。T4DNA連接酶特性■高效連接粘性末端和
4、平末端■T/A克隆■dsDNA切刻修復(fù)■構(gòu)建高豐度克隆文庫■RNA和DNA的連接概述該酶催化雙鏈DNA或RNA上相鄰的5′-磷酸末端和3′-羥基末端形成磷酸二酯鍵。該酶不僅能夠催化平齊末端或粘性末端之間的連接，還可以修復(fù)雙鏈DNA、RNA或DNA/RNA雜交雙鏈中的單鏈切刻。來源純化自E.coliC600pcl857pPLc28lig8。反應(yīng)條件1XT4DNA連接酶反應(yīng)緩沖液[50mMTris-HCl（pH7.5@25℃），10mMMgCl2，10mMDTT，1mMATP]。推薦DNA5′末端濃度為0.1-1.
5、0μM，16℃溫育。熱失活：65℃10分鐘。室溫連接反應(yīng)為方便起見，連接反應(yīng)可以在室溫（20-25℃）條件下進(jìn)行。粘性末端連接：在20μl反應(yīng)體系中加入1μlT4DNA連接酶，反應(yīng)10分鐘。平齊末端連接：在20μl反應(yīng)體系中加入1μlT4DNA連接酶反應(yīng)2小時(shí)，或者加入1μl高濃度T4DNA連接酶反應(yīng)10分鐘。另外，NEB快速連接試劑盒[NEB#M2200S（30次反應(yīng)），或NEB#M2200L（150次反應(yīng)）]可在室溫下5分鐘內(nèi)完成平齊和粘性末端的連接。單位定義（粘性末端活性單位）1單位指在20μl1XT4D
6、NA連接酶反應(yīng)緩沖液中，16℃反應(yīng)條件下，30分鐘能使50%的經(jīng)HindⅢ消化的λDNA片段[5′端濃度為0.12μM（300μg/ml）]連接所需的酶量。濃度400,000units/ml和2,000,000units/ml。注意事項(xiàng)與E.coliDNA連接酶需要NAD+作輔因子不同，T4DNA連接酶的輔因子是ATP。稀釋后的T4DNA連接酶應(yīng)于-20℃、50%甘油貯存緩沖液（稀釋緩沖液A，NEB#B8001）中保存。如稀釋后馬上使用，也可用1XT4DNA連接酶反應(yīng)緩沖液稀釋。只要在反應(yīng)體系中補(bǔ)加1mMATP
7、，連接反應(yīng)就可以在NEB提供的四種限制性內(nèi)切酶緩沖液或在T4DNA多聚核苷酸激酶反應(yīng)緩沖液中進(jìn)行。參考文獻(xiàn)(1)Engler,M.J.andRichardson,C.C.(1982).InP.D.Boyer(Ed.),TheEnzymes,Vol.5,(p.3).SanDiego:AcademicPress.(2)Remaut,E.,Tsao,H.andFiers,W.,(1983)Gene,22,103–113.(3)Sambrook,J.etal.(1989).MolecularCloning:ALabor
8、atoryManual,(2nded.),(pp.1.53–1.73).ColdSpringHarbor:ColdSpringHarborLaboratoryPress.
