酶工程)_動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶

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1、第三章動(dòng)、植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶與微生物細(xì)胞相比，動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞具有各自不同的特性，需采用各自不同的培養(yǎng)工藝。植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)植物、動(dòng)物、微生物細(xì)胞的特性比較細(xì)胞種類植物細(xì)胞微生物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞細(xì)胞大小/um200～3001～1010～100倍增時(shí)間/h﹥120.3-6﹥15營養(yǎng)要求簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單復(fù)雜光照要求大多數(shù)要求不要求不要求對(duì)剪切力敏感大多數(shù)不敏感非常敏感主要產(chǎn)物色素、藥物、香精、酶等醇、有機(jī)酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶等疫苗、激素、單克隆抗體、酶等三者之間的差異主要有：植物細(xì)胞>動(dòng)物細(xì)胞>微生物細(xì)胞。動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞的生產(chǎn)周期比微生物長(zhǎng)。

2、植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞的營養(yǎng)要求較簡(jiǎn)單。植物細(xì)胞的生長(zhǎng)以及次級(jí)代謝物的生產(chǎn)要求一定的光照。植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞對(duì)剪切力敏感。植物、微生物和動(dòng)物細(xì)胞的主要目的產(chǎn)物各不相同。一、植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶從外植體中→選育植物細(xì)胞→高產(chǎn)穩(wěn)定細(xì)胞→培養(yǎng)→各種產(chǎn)物1.植物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)提高產(chǎn)率和產(chǎn)品質(zhì)量縮短周期易于管理2.培養(yǎng)基特點(diǎn)①需要大量無機(jī)鹽②需多種維生素和激素③氮源一般為無機(jī)氮④一般以蔗糖為碳源應(yīng)用最廣的是MS培養(yǎng)基和LS培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基是1962年為煙草細(xì)胞培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基。LS培養(yǎng)基是在其基礎(chǔ)上演變而來的。P82表3-33.培養(yǎng)工藝：——懸浮細(xì)胞

3、培養(yǎng)⑴工藝流程外植體→細(xì)胞的獲取→細(xì)胞培養(yǎng)→分離→純化產(chǎn)物①外植體選擇和處理選取那些無病蟲害、生長(zhǎng)旺盛、生長(zhǎng)規(guī)則植株，把莖、葉、根、芽，花、果實(shí)等切成小片段或小塊。用70%-75%乙醇，0.1%升汞消毒，無菌水漂洗。外植體：從植株取出，經(jīng)過預(yù)處理后，用于植物組織培養(yǎng)的植物組織（包括根、莖、葉、芽、花、果實(shí)、種子等）的片段或小塊。愈傷組織：將上述外植體植入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于25℃左右培養(yǎng)一段時(shí)間，從外植體的切口部位長(zhǎng)出小細(xì)胞團(tuán)。水稻的外植體（幼胚）和愈傷組織外植體愈傷組織②植物細(xì)胞獲取直接分離法愈傷組織誘導(dǎo)法原生質(zhì)體再生法③細(xì)胞懸浮培養(yǎng)：轉(zhuǎn)

4、新培養(yǎng)基，在生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)④分離純化：生化技術(shù)機(jī)械法酶法⑵培養(yǎng)條件的影響與控制①溫度：室溫25℃②pH：微酸性范圍。即pH5.0-6.0③通氣與攪拌④光照的控制：強(qiáng)度和時(shí)間有一定要求⑤前體的添加（飼喂）⑥刺激劑的應(yīng)用4.植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶實(shí)例以大蒜細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)超氧化物歧化酶（SOD）為例(1)大蒜愈傷組織的誘導(dǎo)選取結(jié)實(shí)、飽滿、無病蟲害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用70%乙醇消毒20s，再用0.1%升汞消毒10min，然后無菌水漂洗3次。在無菌條件下，切成0.5cm3的小塊，植入含有3mg/L2,4-D和1.2mg/L6-BA的半固體MS

5、培養(yǎng)基中，在25℃，600lux，12h/d光照條件下培養(yǎng)18d，誘導(dǎo)得到愈傷組織，每18天繼代一次。(2)大蒜懸浮細(xì)胞培養(yǎng)將上述在半固體MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)18d的愈傷組織，在無菌條件下轉(zhuǎn)入含有3mg/L2,4-D和1.2mg/L6-BA（芐基腺嘌呤）的液體MS培養(yǎng)基中，加入滅菌的玻璃珠，25℃，600lux，12h/d光照條件下震蕩培養(yǎng)18d，使愈傷組織分散成為小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞。然后在無菌條件下，經(jīng)過篩網(wǎng)將小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有3mg/L2,4-D和1.2mg/L6-BA的液體MS培養(yǎng)基中，25℃,600lux，12h/d光照條件下震

6、蕩培養(yǎng)18d。(3)酶的分離純化細(xì)胞培養(yǎng)完成后，收集細(xì)胞，經(jīng)過細(xì)胞破碎、提取、分離得到超氧化物歧化酶。二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶1.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞可以產(chǎn)生各種有效高價(jià)值的物質(zhì)需添加抗生素（常用青霉素和鏈霉素聯(lián)合）細(xì)胞生長(zhǎng)速度慢細(xì)胞體積大，無細(xì)胞壁保護(hù)，對(duì)剪切力敏感。反應(yīng)過程成本高，產(chǎn)品價(jià)格貴細(xì)胞具有錨地依賴性。宜采用貼壁培養(yǎng)原代細(xì)胞一般繁殖50代2.培養(yǎng)方式(1)懸浮培養(yǎng)(2)貼壁培養(yǎng)滾瓶培養(yǎng)微載體培養(yǎng)(microcarrierculture)(3)固定化細(xì)胞培養(yǎng)包埋(entrapment)和中空纖維(microencapsula

7、tion)培養(yǎng)3.工藝控制⑴工藝流程種質(zhì)細(xì)胞（體細(xì)胞；雜交瘤細(xì)胞）分散成懸浮細(xì)胞細(xì)胞懸浮或貼壁培養(yǎng)收集分離純化產(chǎn)物胰蛋白酶消化⑵培養(yǎng)條件的影響與控制①溫度：一般控制在36.5℃.②pH值：一般控制在7.0-7.6的微堿性范圍內(nèi)。③滲透壓:應(yīng)與細(xì)胞內(nèi)滲透壓相同。④溶解氧：根據(jù)情況隨時(shí)調(diào)節(jié)。4.產(chǎn)酶實(shí)例以人黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)組織纖溶酶原激活劑為例纖溶酶原纖溶酶纖溶酶原激活劑①種質(zhì)細(xì)胞用胰蛋白酶處理，分散，pH7.4磷酸鹽洗滌。稀釋成細(xì)胞懸浮液②接種到反應(yīng)器中，與37℃CO2培養(yǎng)箱中，長(zhǎng)成致密單層③去培養(yǎng)液，用pH7.4磷酸鹽沖洗細(xì)胞④換無

8、血清Eagle培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)⑤每3-4天，取出培養(yǎng)液分離純化⑥再加新鮮Eagle培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)⑦親和層析進(jìn)行分離細(xì)胞生產(chǎn)滾瓶培養(yǎng)裝置第一章作業(yè)：1.概念酶活力單位酶比活力2.酶工程的主要任務(wù)和主要內(nèi)容是