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1、革蘭氏染色與莢膜染色1、掌握革蘭氏染色法和細(xì)菌莢膜染色法。2、觀察菌體的一些簡單結(jié)構(gòu)。二、實驗原理一、目的與要求：（一）革蘭氏染色法原理革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家C.Gram創(chuàng)立的。作為細(xì)菌學(xué)上最常用最重要的鑒別染色法，革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G－）兩大類。G－菌的細(xì)胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂質(zhì)，增加了細(xì)胞壁的通透性，使初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)菌就被脫色，再經(jīng)番紅復(fù)染后就成紅色。G+菌細(xì)胞
2、壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細(xì)菌仍保留初染時的顏色。（二）莢膜染色法原理莢膜是包圍在細(xì)菌細(xì)胞外的一層粘液狀或膠質(zhì)狀物質(zhì)。由于莢膜與染料的親和力弱，不容易著色；而且可溶于水，易在用水沖洗時被除去。所以通常用襯托染色法(負(fù)染色法)染色，使菌體和背景著色，而莢膜不著色，從而在菌體周圍形成一透明圈。由于莢膜富含水分，制片時應(yīng)自然干燥，不可以加熱固定，避免加熱蒸發(fā)，影響觀察。三、實驗器材1、菌種：枯草桿菌（Bacillussubtilis），大腸桿菌（Escherich
3、iacoli），未知菌（環(huán)境中分離）（斜面培養(yǎng)物）褐球固氮菌（Azotobacterchroococcus）裝片。2、染色液和試劑：草酸銨結(jié)晶紫、盧戈氏碘液、95%乙醇、番紅、二甲苯、香柏油3、器材：顯微鏡、洗瓶、載玻片、接種環(huán)、酒精燈、擦鏡紙、廢液缸四、革蘭氏染色法實驗步驟流程路線：涂片干燥固定草酸銨結(jié)晶紫染色1min水洗干燥碘液媒染1min水洗干燥95%乙醇脫色15~20秒水洗干燥番紅復(fù)染1min水洗干燥鏡檢(1)涂片干燥固定:21（2）草酸銨結(jié)晶紫染色1min水洗干燥（3）碘液媒染1min水洗干燥（4）95%乙醇脫色15
4、~20秒水洗干燥（5）番紅復(fù)染1min水洗干燥鏡檢五、注意事項：（1）在涂片時不可過厚，否則在染色脫色時，都不易均勻，固定時，不可過熱，以載玻片不燙手為宜。（2）嚴(yán)格掌握脫色程度，是革蘭氏染色的關(guān)鍵步驟。如脫色時間太長，陽性菌會誤為革蘭氏陰性菌，時間不足，革蘭氏陰性菌會誤為革蘭氏陽性菌。（3）在鏡檢時，以分散開的菌體的革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)。（4）染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應(yīng)吸去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。（5）選用幼齡的細(xì)菌。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。莢膜示意圖：莢
5、膜染色步驟：1、總路線：涂片用1%結(jié)晶紫染色3分鐘用20%CuSO4沖洗鏡檢2、涂片：3、結(jié)晶紫染色：4、CuSO4沖洗：注意事項：（1）不能加熱固定，否則莢膜受熱失水收縮，失去原形。（2）涂片不要用力過猛，不要滴加水，以防破壞其莢膜原形.(3)要用CuSO4沖洗，不要用水。第4組值日莢膜示意圖：革蘭氏染色步驟 涂片干燥固定草酸銨結(jié)晶紫染色1min水洗干燥碘液媒染1min水洗干燥95%乙醇脫色15~20秒水洗干燥番紅復(fù)染1min水洗干燥鏡檢莢膜染色步驟：涂片用1%結(jié)晶紫染色3分鐘用20%CuSO4沖洗鏡檢1、細(xì)胞壁實驗報告給出
6、枯草桿菌，大腸桿菌，未知菌形態(tài)圖，并注明其革蘭氏染色反應(yīng)。繪圖示褐球固氮菌的形態(tài)特征思考題1.哪些環(huán)節(jié)會影響革蘭色染色結(jié)果的正確性？其中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是什么？2.進(jìn)行革蘭氏染色時，為什么特別強調(diào)菌齡不能太老，用老齡細(xì)菌染色會出現(xiàn)什么問題?3.革蘭氏染色時，初染前能加碘液嗎?乙醇脫色后復(fù)染之前，革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌應(yīng)分別是什么顏色?4.不經(jīng)過復(fù)染這一步，能否區(qū)別革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌？
