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1、革蘭氏染色與莢膜染色1、掌握革蘭氏染色法和細(xì)菌莢膜染色法。2、觀察菌體的一些簡單結(jié)構(gòu)。二、實驗原理一、目的與要求:(一)革蘭氏染色法原理革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家C.Gram創(chuàng)立的。作為細(xì)菌學(xué)上最常用最重要的鑒別染色法,革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌(G+)和革蘭氏陰性菌(G-)兩大類。G-菌的細(xì)胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì),而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低,故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂質(zhì),增加了細(xì)胞壁的通透性,使初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出,結(jié)果細(xì)菌就被脫色,再經(jīng)番紅復(fù)染后就成紅色。G+菌細(xì)胞
2、壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高,類脂質(zhì)含量少,經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小,通透性降低,因此細(xì)菌仍保留初染時的顏色。(二)莢膜染色法原理莢膜是包圍在細(xì)菌細(xì)胞外的一層粘液狀或膠質(zhì)狀物質(zhì)。由于莢膜與染料的親和力弱,不容易著色;而且可溶于水,易在用水沖洗時被除去。所以通常用襯托染色法(負(fù)染色法)染色,使菌體和背景著色,而莢膜不著色,從而在菌體周圍形成一透明圈。由于莢膜富含水分,制片時應(yīng)自然干燥,不可以加熱固定,避免加熱蒸發(fā),影響觀察。三、實驗器材1、菌種:枯草桿菌(Bacillussubtilis),大腸桿菌(Escherich
3、iacoli),未知菌(環(huán)境中分離)(斜面培養(yǎng)物)褐球固氮菌(Azotobacterchroococcus)裝片。2、染色液和試劑:草酸銨結(jié)晶紫、盧戈氏碘液、95%乙醇、番紅、二甲苯、香柏油3、器材:顯微鏡、洗瓶、載玻片、接種環(huán)、酒精燈、擦鏡紙、廢液缸四、革蘭氏染色法實驗步驟流程路線:涂片干燥固定草酸銨結(jié)晶紫染色1min水洗干燥碘液媒染1min水洗干燥95%乙醇脫色15~20秒水洗干燥番紅復(fù)染1min水洗干燥鏡檢(1)涂片干燥固定:21(2)草酸銨結(jié)晶紫染色1min水洗干燥(3)碘液媒染1min水洗干燥(4)95%乙醇脫色15
4、~20秒水洗干燥(5)番紅復(fù)染1min水洗干燥鏡檢五、注意事項:(1)在涂片時不可過厚,否則在染色脫色時,都不易均勻,固定時,不可過熱,以載玻片不燙手為宜。(2)嚴(yán)格掌握脫色程度,是革蘭氏染色的關(guān)鍵步驟。如脫色時間太長,陽性菌會誤為革蘭氏陰性菌,時間不足,革蘭氏陰性菌會誤為革蘭氏陽性菌。(3)在鏡檢時,以分散開的菌體的革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)。(4)染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后,應(yīng)吸去玻片上的殘水,以免染色液被稀釋而影響染色效果。(5)選用幼齡的細(xì)菌。若菌齡太老,由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。莢膜示意圖:莢
5、膜染色步驟:1、總路線:涂片用1%結(jié)晶紫染色3分鐘用20%CuSO4沖洗鏡檢2、涂片:3、結(jié)晶紫染色:4、CuSO4沖洗:注意事項:(1)不能加熱固定,否則莢膜受熱失水收縮,失去原形。(2)涂片不要用力過猛,不要滴加水,以防破壞其莢膜原形.(3)要用CuSO4沖洗,不要用水。第4組值日莢膜示意圖:革蘭氏染色步驟涂片干燥固定草酸銨結(jié)晶紫染色1min水洗干燥碘液媒染1min水洗干燥95%乙醇脫色15~20秒水洗干燥番紅復(fù)染1min水洗干燥鏡檢莢膜染色步驟:涂片用1%結(jié)晶紫染色3分鐘用20%CuSO4沖洗鏡檢1、細(xì)胞壁實驗報告給出
6、枯草桿菌,大腸桿菌,未知菌形態(tài)圖,并注明其革蘭氏染色反應(yīng)。繪圖示褐球固氮菌的形態(tài)特征思考題1.哪些環(huán)節(jié)會影響革蘭色染色結(jié)果的正確性?其中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是什么?2.進(jìn)行革蘭氏染色時,為什么特別強調(diào)菌齡不能太老,用老齡細(xì)菌染色會出現(xiàn)什么問題?3.革蘭氏染色時,初染前能加碘液嗎?乙醇脫色后復(fù)染之前,革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌應(yīng)分別是什么顏色?4.不經(jīng)過復(fù)染這一步,能否區(qū)別革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌?