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《DNA及寡核苷酸探針在原位雜交組織化學(xué)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、中國(guó)試劑網(wǎng)6.3.1.3DNA及寡核苷酸探針在原位雜交組織化學(xué)一、DNA探針的應(yīng)用雖然一般認(rèn)為DNA探針敏感度不如cRNA探針，但在病毒的檢測(cè)等領(lǐng)域中DNA探針仍得到廣泛的應(yīng)用。在原位雜交細(xì)胞化學(xué)的操作步驟方面與cRNA探針基本相同，所不同的是：（1）雜交時(shí)需先在高溫80～95℃短時(shí)處理，使DNA探針及細(xì)胞內(nèi)靶DNA變性，解離成單鏈，迅置于冰上冷卻。然后置于37℃～42℃雜交過夜。（2）RNA酶的溶液的沖洗不能減低背景，因此，在操作步驟中省略此步。（一）地高辛-堿性磷酸酶（Dig-AKP）標(biāo)記DNA探針在石蠟包埋切片檢測(cè)病毒DNA中的應(yīng)用1．組織前處理（1）固定：組
2、織以10%中性福爾馬林液或Bouins液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片厚4～6μm，粘附于涂有粘附劑的玻片上，入烤箱60～80℃6～8h，使切片更緊貼玻片。（2）脫蠟：二甲苯10min×2，自100%乙醇，90%，70%，50%，30%各5min。入PBS（含5mmol/lMgCl2,pH7.3～7.4）10min×2。入0.2nHCl20min以進(jìn)一步去除蛋白。（3）50℃2×SSC，含5mmol/lEDTA溶液中30min。（4）蛋白酶K（1μg/ml溶于0.1mol/lPBS中，）37℃20～25min。（5）0.2mol/l甘氨酸液：室溫10min，中止蛋白酶反應(yīng)
3、。（6）4%多聚甲醛（PBS新鮮配制）：室溫20min。（7）PBS/5mmol/lMgCl2漂洗10min×2。（8）脫水，自低濃度到高濃度，無水乙醇各3min，空氣干燥。2．預(yù)雜交封閉非特異性雜交位點(diǎn)，20μl/每張切片，42℃水浴半小時(shí)。3．雜交10～20μl/每張切片，加蓋硅化蓋玻片，將切片置于95℃min，使探針及病毒DNA變性，然后迅速置于冰上1min（也有報(bào)告用乙醇使之冷卻的），然后將切片置于盛有2×SSC濕盒內(nèi)，42℃過夜（16～18h）。4．雜交后漂洗（1）2×SSC液內(nèi)振動(dòng)移除蓋片。中國(guó)試劑網(wǎng)6.3.1.3（2）2×SSc55℃10min×2。（
4、3）0.5×SSc55℃5min×2。（4）緩沖液II（含0.5%封阻試劑，用緩沖液I溶解）37℃30min。（5）緩沖液I（10mmol/lTris–HCl,15.0mmol/LNaClpH7.5）15min，室溫。（6）酶標(biāo)地高辛抗體（1：5000，應(yīng)用緩沖液I稀釋）37℃30min。（7）緩沖液i15min×2室溫。（8）緩沖液III（100mmol/lTris-HCl,100mmol/LNaCl,50mmol/LMgCl2,pH9.5）室溫2min。5．顯色（1）顯色液配制：緩沖液III：1ml中加入4.5μl四氮唑藍(lán)（NBT），3.5μlX-磷酸鹽（5-溴
5、-4-氯-3吲哚磷酸鹽（BCIP配成））。30μl/每張切片，置暗處顯色30min到2h。定時(shí)抽查切片，鏡檢其顯色情況。（2）緩沖IV（10mmol/lTris–HCl,1mmol/LEDTA,pH8.0）10min終止反應(yīng)，甲綠復(fù)染5min，二甲苯透明，DPX封固，鏡檢。（二）熒光標(biāo)記DNA探針的應(yīng)用1．概述在原位雜交細(xì)胞化學(xué)中熒光標(biāo)記DNA探針（FluorescenceinsituDNAhybridisa－tion,FISH）的應(yīng)用在細(xì)胞培養(yǎng)和染色體鋪片（見二十一章）中較為廣泛。FISH屬于非放射性標(biāo)記，其優(yōu)點(diǎn)在于簡(jiǎn)便，快速，其敏感性可與放射性同位素標(biāo)記核酸探針
6、相等。不少實(shí)驗(yàn)室報(bào)告應(yīng)用FISH（2～5kbp探針）可成功地達(dá)到單個(gè)拷貝（copy）的特異性定位。2．熒光標(biāo)記DNA探針應(yīng)用于ISHH中的基本原則（BarbaraTraok和DanPinkel1990）（1）首先應(yīng)使組織或染色體中靶核苷酸高溫加熱變性解離為單鏈DNA，化學(xué)性標(biāo)記的DNA探針除外。（2）雜交：一般在37℃進(jìn)行，探針稀釋濃度在2ng/μl，染色體鋪片探針濃度在0.4ng/μl,雜交液2～3μl/每cm2蓋片，每張蓋片大約1.8cm2，約需10μl雜交液。有實(shí)驗(yàn)室報(bào)告，如每張蓋片（溫度為室溫）加入雜交液將會(huì)降低雜交溫度所需要的37℃，因此，建議對(duì)蓋片應(yīng)用前
7、在37℃進(jìn)行預(yù)熱。（3）用免疫細(xì)胞化學(xué)或組織化學(xué)方法顯示熒光標(biāo)記。自80年代以來，熒光中國(guó)試劑網(wǎng)6.3.1.3素標(biāo)記檢測(cè)系統(tǒng)日益增加。包括：①生物素標(biāo)記探針與熒光素標(biāo)記的抗生物素（avidin）或抗生物素抗體。②氨乙酰基熒光（aminoacetylfluroence,AAF）-改良探針（modifiedprobe），與抗AAF抗血清。③磺酸（sulfonatc）改良探針，以抗磺酸抗血清檢測(cè)（OrganicLtd,Yavene,Israel和TMcBioproductsRocklandME可提供此藥盒）。④汞標(biāo)記探針（mercuratedprobe），以硫氫基（s
