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1、DNA探針在原位雜交技術(shù)的使用技巧分析【摘要】小編為您整理了DNA探針在原位雜交技術(shù)的使用技巧分析，網(wǎng)站內(nèi)容每天更新，歡迎大家時時關注哦!雖然早在20世紀60年代末70年代初原位雜交技術(shù)就已經(jīng)誕生畢業(yè)論文，但是當時采用的是放射性的DNA探針，存在人身安全及探針處理等問題。直至原位雜交技術(shù)開始使用熒光標記DNA探針，這才開啟了熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybri-dization，F(xiàn)ISH)的時代。熒光原位雜交技術(shù)是一種應用熒光物質(zhì)依靠核酸探針雜交原理在核中或染色體上顯示DNA序列位置的方法。與傳統(tǒng)的放射性標記原位雜交相比，F(xiàn)ISH具有安全、快速、經(jīng)濟、靈敏度高、檢
2、測信號強、雜交特異性高、能同時顯示多種顏色等優(yōu)點，因此自該技術(shù)問世以來，發(fā)展迅速，并廣泛應用于分子生物學、醫(yī)學、細胞遺傳學等許多領域。1FISH技術(shù)的原理及操作步驟FISH的基本原理是用已知的標記單鏈核酸作探針，按照堿基互補的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進行異性結(jié)合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以探針直接與染色體進行雜交從而將特定的基因定位在染色體上，可以對待測核酸定性、定位或相對定量分析。FISH的基本操作步驟包括染色體制備、探針標記、將探針與實驗材料靶序列雜交以及檢測雜交結(jié)果。(1)染色體制備。原位雜交的效率取決于探針與染
3、色體的靠近程度，因此獲得背景清晰、染色體分散、形態(tài)較好的中期分裂相是FISH中很關鍵的一步。(2)探針的制備。常用的探針包括三類，第一類是染色體特異重復序列探針，包括α衛(wèi)星和衛(wèi)星Ⅲ類探針等，雜交靶位常大于1Mbp，不含散在重復序列、與靶位結(jié)合緊密、雜交信號強、易于檢測，常用于檢測間期細胞非整倍體和微小標志染色體;第二類是全染色體或染色體區(qū)域特異性探針，這類探針由一條染色體或染色體上某一區(qū)域幾個不同核酸片段組成，可由克隆到噬菌體和質(zhì)粒上的染色體特異性大片段通過構(gòu)建文庫制備，由于所得探針片段較小，故雜交時與鄰近區(qū)域發(fā)生重疊及制片過程中被破壞的可能性較小，常用于中期染色體重組和間期
4、核結(jié)構(gòu)分析;第三類是位點特異性探針，這類探針由一個或幾個克隆序列組成，可由cDNA克隆或克隆到大片段插入載體的核酸片段制備。主要用于染色體DNA克隆序列的定位和靶DNA序列拷貝數(shù)及結(jié)構(gòu)變化的檢測[12,]。探針用特定分子標記，酶解為200-400bp，這樣能增強特異性雜交，同時又減少本底熒光。探針的的熒光素標記分為直接標記法和間接標記法。直接標記法是用熒光染料直接標記核苷酸，常用熒光染料有異硫氰酸熒光素及羅丹明等。間接標記法是先在DNA探針上連接一種半抗原，然后通過能與半抗原特異結(jié)合的標記蛋白對目標核酸分子進行檢測。最常用半抗原是生物素和地高辛酸基等。探針的標記方法采用缺口平移法、PCR
5、擴增法、隨機引物標記法、RNA體外轉(zhuǎn)錄法等。探針標記通常有兩個目的：一方面將標記好的核苷酸加入到探針序列中去，另一方面可以將DNA片段長度縮小到500bp以下。(3)原位分子雜交。最佳雜交條件取決于探針和目標的性質(zhì)。在含有甲酰胺(DNA變性劑)、硫酸葡聚糖(一種高分子惰性聚合物)和鹽的雜交液中混合標記的探針(200～500bp)。變性后，將探針混合液置于玻片上，如果檢測染色體特異重復序列，37℃溫育15min;而對于單序列大的插入探針，探針混合物先和未標記的基因組或者CotI重復序列預雜交1h(探針中非特異的重復序列被封閉，抑制重復序列結(jié)合靶DNA)，然后與探針37℃雜交過夜。(4)熒光
6、標記。錯配或未雜交的探針經(jīng)過洗脫后,把玻片與免疫熒光試劑共同溫育,在探針雜交的位置形成熒光。常用的熒光標記物為熒光素異硫氰酸鹽(FITC)、羅丹明、德克薩斯(Texas)紅等，其它光譜從藍色到紅色的熒光物質(zhì)都可用于多種顏色分析。檢測常用于標記的熒光分子及其特征如表1。(5)檢測分析。將雜交好的片子置于熒光顯微鏡下，選擇合適的濾光片觀察并照相,也可用共焦激光掃描記入計算機。熒光鏡檢時顯微鏡的質(zhì)量及濾片的選擇，是獲得滿意結(jié)果的重要影響因素，尤其是濾片系統(tǒng)，應嚴格按照表1所列的熒光激發(fā)/發(fā)射光波長，選擇最適的激發(fā)/阻擋濾片組合。2FISH技術(shù)的發(fā)展原位雜交技術(shù)是Gall和Pardue(1969
7、)分別發(fā)現(xiàn)的，利用放射性同位素標記的DNA探針檢測細胞制片上非洲爪蟾細胞核內(nèi)的rDNA[3,4]，當時是使用放射性同位素標記核酸用于原位雜交。隨著分子克隆、同位素標記和核酸的化學合成技術(shù)的發(fā)展，在上世紀八十年代逐漸用非放射性半抗原如生物素進行核酸標記，雖然摒棄了放射性同位素，但方法繁瑣、敏感度低、背景高[5]。1986年FISH技術(shù)問世，該法具有敏感度高、信號強、背景低、快速等優(yōu)點[6,7]，因此得到的迅速的發(fā)展，在方法上逐步形成了
