巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)化策略

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1、!"卷#期微生物學(xué)報(bào)%&’(!"-&(##$$"年!月!"#$%&"’()&(*(+&"$,&-&"$)*+,’#$$"!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)化策略李洪釗李亮助孫強(qiáng)明!宏映"（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所昆明CA$>>D）!"#$"%&’%()*#+,"’-’.’/&.&"/&$0$1#(’&101,#%((’*/!2("%-"E,F&32B41&E,E,132B4=G=3H,1320,32I132F&325,32（!"#$%$&$’()*’+%,-./%(.

2、(01，23%"’#’4,-+’51()*’+%,-.6,%’",’#，7&"5%"0CA$>>D，23%"-）關(guān)鍵詞：巴斯德畢赤酵母，表達(dá)，優(yōu)化策略中圖分類(lèi)號(hào)：H@DC文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：)文章編號(hào)：$$$>/C#$?（#$$"）$#/$#DD/$A巴斯德畢赤酵母（8%,3%-9-#$(:%#，J*）表達(dá)系統(tǒng)是目前分子生物學(xué)領(lǐng)域中用于表達(dá)重組蛋白的標(biāo)準(zhǔn)工具之一。J*的如下優(yōu)點(diǎn)是促成此表達(dá)系統(tǒng)在近十幾年里迅速發(fā)展和被廣泛應(yīng)用的重要原因：J*為單細(xì)胞真核生物，生長(zhǎng)快，易于分子遺傳學(xué)操作；J*的醇氧化酶（>)’8&4&’KL,<1;:>，4;<>）基因的啟動(dòng)子具有強(qiáng)誘導(dǎo)性和強(qiáng)啟

3、動(dòng)性，適于外源基因的高水平誘導(dǎo)表達(dá)；J*具有強(qiáng)烈的好氧生長(zhǎng)偏愛(ài)性，可進(jìn)行細(xì)胞高密度培養(yǎng)，利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；J*可高水平分泌表達(dá)外源蛋白，純化方便；J*具有真核細(xì)胞的翻譯后修飾功能。迄今已有#$$多種外源蛋白在J*中獲得表達(dá)。但也有許多蛋白表達(dá)不理想，甚至不能表達(dá)。要實(shí)現(xiàn)目的蛋白在J*中的成功表達(dá)并兼顧其實(shí)用性和安全性，必須充分考慮影響表達(dá)和應(yīng)用的各種因素并采取有效的優(yōu)化策略。3目的基因的特性目的基因的特性是決定表達(dá)成敗的首要因素。許多高)MN含量的基因由于成熟前終止而不能有［>］效轉(zhuǎn)錄。特定的)MN富含區(qū)可作為多腺苷酸或轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，導(dǎo)致僅產(chǎn)生低水平或截短的0O

4、-)。某些稀有密碼子，尤其是稀有密碼子密集區(qū)往往成為制約翻譯速率的因素。目的基因特性對(duì)表達(dá)的影［#］［"］響被認(rèn)為是一種具有種屬特異性的現(xiàn)象。在某些情況下，可通過(guò)定點(diǎn)突變?nèi)コ墒烨敖K止結(jié)構(gòu)域［!］和替換稀有密碼子。但在更極端的情況下，即基因中存在大量)MN富含區(qū)和稀有密碼子密集區(qū)時(shí)，［A］往往需要進(jìn)行全基因合成，使編碼序列符合J*偏愛(ài)性密碼子用法和具有更高的IM9含量。4啟動(dòng)子選擇［C］最廣泛應(yīng)用的啟動(dòng)子J)KP（>醇氧化酶>啟動(dòng)子），是由甲醇誘導(dǎo)的強(qiáng)啟動(dòng)子。在某些情況下J)KP>的使用受到限制，例如：甲醇不適用于食品工業(yè)生產(chǎn)，也是一種火災(zāi)隱患。故其它不用甲醇誘導(dǎo)的

5、啟動(dòng)"通訊作者。./01,’：21324&325,3264&701,’(8&0"9&++:;*&3<,321=74&+(./01,’：21324&325,3264&701,’(8&0作者簡(jiǎn)介：李洪釗（>?@#/），男，天津人，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所在讀碩士研究生，>??A年畢業(yè)于南開(kāi)大學(xué)生命科學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，現(xiàn)主要從事基因工程藥物方面的研究。./01,’：4&32B41&’,64&701,’(8&0收稿日期：#$$#/$!/$A，修回日期：#$$#/$?/>@2期李洪釗等：巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)化策略2*-子也引人注目。［$］!"#（!三磷酸甘

6、油醛脫氫酶啟動(dòng)子）是一種組成型強(qiáng)啟動(dòng)子。使用!"#!在發(fā)酵時(shí)不需甲醇誘導(dǎo)，不必更換碳源，工藝簡(jiǎn)單。但!"#!不宜用于表達(dá)對(duì)!%有毒的蛋白。!&’(（)依賴(lài)谷胱甘肽的甲醛脫氫酶啟動(dòng)［*］子）在以甲醇為單一碳源或以甲胺為單一氮源時(shí)，被強(qiáng)烈誘導(dǎo)。使用!&’()可選擇以甲醇或甲胺（一種廉價(jià)的無(wú)毒氮源）誘導(dǎo)高水平表達(dá)，為選擇符合實(shí)際應(yīng)用要求的啟動(dòng)子提供了靈活性，也擴(kuò)大了!%的應(yīng)用范圍。在!#+,)、!"#!、和!&’()這些強(qiáng)啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下，某些外源蛋白的表達(dá)水平過(guò)高，超過(guò)了宿主細(xì)胞翻譯［-，).］后處理加工能力所能承擔(dān)的最大負(fù)荷，引起蛋白的錯(cuò)折疊、不加工或錯(cuò)定位。此時(shí)或在其

7、他一些應(yīng)［))］用情況下，需要選擇較溫和的啟動(dòng)子，如!!/,（*一種過(guò)氧化物酶體基質(zhì)蛋白啟動(dòng)子）和!0!1（)一種"1!［)2］酶啟動(dòng)子）。!345#的非翻譯區(qū)（614）614對(duì)蛋白表達(dá)的影響主要表現(xiàn)在345#的翻譯水平上。!"#)345#的7’614長(zhǎng)))89:，富含#;6。目的蛋白345#應(yīng)盡可能具有與!"#)345#相近，最好是相同的7’614。一般地，目的基因編碼序列的第一個(gè)#1"應(yīng)盡可能接近，最好處于!"#)#1"的位置，此位置對(duì)應(yīng)于大多數(shù)載體多克隆位點(diǎn)的第一個(gè)限制酶切點(diǎn)處。<=>>?=@AB9C等通過(guò)調(diào)整人血清白蛋白345#與!"#)345#的7’6