抑制性消減雜交技術(shù)主要包括如下幾個基本步驟

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1、抑制性消減雜交技術(shù)主要包括如下幾個基本步驟：（1）雙鏈cDNA合成與酶切：分別提取待比較的兩組細胞mRNA（實驗方tester、驅(qū)趕方driver），利用隨機引物反轉(zhuǎn)錄為雙鏈cDNA后，用四堿基識別酶如RsaI或HindⅢ切割成平均大小為600bp左右的平端片段；該酶約在44=256bp處就有一個切點，一分子而來的雙鏈cDNA經(jīng)該酶酶切后，可產(chǎn)生數(shù)個片段，每個片段一般＜600bp，可防止長鏈cDNA片段所形成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)對有效消減雜交的干擾。（2）兩次消減雜交：將testercDNA分為兩組，分別于其5'端上接上兩種不同的具有一段反向末端重復(fù)序列

2、的寡聚核苷酸、去磷酸化接頭（adaptor1,adaptor2），以利于隨后的選擇性擴增。接頭設(shè)計特點：①接頭是由一長鏈（約40余個核苷酸）和一短鏈（約10余個核苷酸）組成的一端是平端的雙鏈DNA片段，而且雙鏈的5′均無磷酸基團，保證了接頭以唯一方向與cDNA片段連接，即接頭長鏈的3′端與cDNA雙鏈5′端連接；②接頭長鏈外側(cè)（約20余個核苷酸）序列與第一次PCR引物序列相同，內(nèi)側(cè)序列與第二次PCR引物序列相同；③在接頭上含有T7啟動子序列，并且含有內(nèi)切酶識別位點，為以后該片段插入克隆載體提供酶切位點。兩組testercDNA樣品分別與過量的d

3、rivercDNA進行第一次雜交，得到a、b、c、d四型分子，使原來豐度不同的單鏈cDNA得到大量富集，兩組產(chǎn)物另加上新變性的drviercDNA再次雜交，這樣就產(chǎn)生了兩個5'端有兩個不同接頭的e型分子，這種e型分子正是tester較driver特異表達cDNA，填平粘性末端。第一次雜交中，將過量的drivercDNA分別加入兩份testercDNA中，變性后退火雜交。第一次雜交后有4種產(chǎn)物a、b、c、d：a是單鏈testercDNA；b是自身退火的testercDNA雙鏈；c是tester和driver的異源雙鏈；d是drivercDNA。第

4、一次雜交是使tester單鏈cDNA均等化，即是原來有豐度差別的單鏈cDNA的相對含量達到基本一致。這種均等化的實現(xiàn)是依據(jù)雜交的二級動力學(xué)原理，豐度高的單鏈cDNA在退火時產(chǎn)生同源雜交的速度要快于豐度低的單鏈cDNA。同時，由于testercDNA中和drivercDNA序列相似的片段大都和driver形成異源雙鏈分子c，使testercDNA中的差異表達基因的目標(biāo)cDNA得到大量富集。第一次雜交后，合并兩份雜交產(chǎn)物，另加上新的變性driver單鏈，再次雜交退火。在這一次雜交中，只有第一次雜交后剩余的經(jīng)均等化和消減的單鏈testercDNA能與

5、drivercDNA一起形成各種雙鏈分子。這次雜交進一步富集了差異表達基因的cDNA，并產(chǎn)生了一種新的雙鏈分子e，這種分子的兩個5′端有兩個不同的接頭（接頭1和接頭2），正是由于這兩個不同的接頭，使其能在以后的PCR中被有效的擴增。（3）兩輪抑制性PCR：兩次雜交后，填平粘性末端，利用巢式PCR原理進行擴增，將兩個長接頭序列設(shè)計成內(nèi)外兩對引物，先用外側(cè)那對引物進行PCR反應(yīng)?；赑CR抑制效應(yīng)的存在，只有那些代表了具有差異表達的，且兩端同時接有不同接頭的雙鏈cDNA片段（e型分子）才能在PCR中得到以指數(shù)擴增，而a、d類分子沒有引物結(jié)合點，b類

6、分子由于兩端均為同一接頭，在鏈內(nèi)極易形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，故此3類分子均不能得以擴增，而c類分子一端無接頭，只能線性擴增。這樣經(jīng)過兩輪PCR使差異表達的基因片段再次得到富集而構(gòu)建成由差異cDNA片段構(gòu)成的消減文庫。換言之，e型分子兩端都能和引物配對，擴增效率高，而c型的雙鏈分子只在一端有一個引物配對，擴增效率比e型分子低得多，b型分子由于兩端有長序列的反向重復(fù)，可互補形成牢固的“鍋-柄”二級結(jié)構(gòu)，無法進行有效擴增。第二輪PCR再用內(nèi)側(cè)那對引物進行配對，可極大提高擴增的特異性，使在最后的PCR產(chǎn)物中絕大部分是e型分子。（4）消減文庫的擴增與鑒定：將消減文

7、庫中的差異表達的cDNA片段以適當(dāng)方式（T/A方式或酶切粘性末端互補方式）插入載體，轉(zhuǎn)化細菌，擴增文庫后，經(jīng)x-gal藍白斑/抗生素初步篩選后，隨機挑取白色克隆制備質(zhì)粒，酶切后分析插入片段。（5）對克隆出的片段進一步分析鑒定：包括用二次PCR產(chǎn)物制備探針，經(jīng)點雜交篩選陽性克?。灰圆迦隿DNA片段為探針進行Northernblot鑒定差異表達；cDNA序列測定，序列同源性分析；通過文庫篩選或步移技術(shù)獲取完整的差異表達基因全長。抑制性消減雜交技術(shù)較以往差異基因克隆方法有了重要改進，具有三者無法比擬的優(yōu)點：（1）高度的特異性，這主要來源于以下三個方面

8、的設(shè)計特點：a、使用四堿基識別酶酶切，產(chǎn)生＜600bp的片段，這樣可防止cDNA片段形成復(fù)雜結(jié)構(gòu)而影響雜交，同時使同一基因家族來源的片段不易交互雜交，