資源描述:
《PCR技術(shù)及其應(yīng)用》由會(huì)員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、PCR技術(shù)及其應(yīng)用§1PCR技術(shù)原理§2PCR技術(shù)應(yīng)用PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明1971年,1971年,美國(guó)麻省理工(MIT)教授、1968年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主Khorana提出:經(jīng)過(guò)DNA變性,與合適引物雜交,用DNA聚合酶延伸引物,并不斷重復(fù)該過(guò)程便可克隆tRNA基因。但由于測(cè)序和引物合成的困難,以及且當(dāng)時(shí)(1970年)Smith等發(fā)現(xiàn)了DNA限制性內(nèi)切酶,使體外克隆基因成為可能,所以,使Khorana等的早期設(shè)想被人們遺忘……PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明1985年,美國(guó)PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)(P
2、CR);基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制;最初采用E-coliDNA聚合酶進(jìn)行PCR,由于該酶不耐熱,使這一過(guò)程耗時(shí),費(fèi)力,且易出錯(cuò);耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行,隨后PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀;1993年,Mullis等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。KaryB.Mullis<>,1989年美國(guó)《Science》雜志列PCR為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。引物引物
3、Mullis的構(gòu)思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段TaqDNA聚合酶(thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)40506070809010010080604020二、PCR的基本原理PCR基本原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。PCR的基本步聚1、變性(Denaturation):通過(guò)加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂,雙鏈解離形成單鏈DNA。2、退火(Annealing):當(dāng)溫度突然降低時(shí),反應(yīng)體系中引物和其互補(bǔ)的DNA模板在局部形成雜交鏈。3、延伸(Extension):在DN
4、A聚合酶和4種脫氧核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)及Mg2+存在條件下,5’→3’的聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的DNA鏈延伸反應(yīng)。這種熱變性-復(fù)性-延伸的過(guò)程就是一個(gè)PCR循環(huán),PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。72℃94℃55℃PCR循環(huán)(30-40)變性退火延伸PCR反應(yīng)程序PCR反應(yīng)程序PCRCycle-Step1-DenaturationTemplateDNAbyHeat(95℃)TargetSequenceTargetSequencePCR原理示意圖①模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PC
5、R擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備;5’3’3’5’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG5’3’3’5’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG加熱94℃引物酶②模板DNA與引物的退火(復(fù)性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合;PCRCycle-Step2–Temperatureislowered(Tm)andprimersanne
6、altotargetsequencesTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’引物酶3’5’3’5’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG引物ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC引物3’5’5’3’PCRCycle-Step3-At72℃TaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporatedTargetSequenceTargetSequencePri
7、mer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase③引物的延伸:DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板,按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理,合成一條新的與模板DNA鏈。3’5’3’5’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCDNA聚合酶TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGDNA聚合酶5’5’3’3’引物引物Endofthe1stPCRCycle–R