PCR技術(shù)及其應(yīng)用

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1、PCR技術(shù)及其應(yīng)用§1PCR技術(shù)原理§2PCR技術(shù)應(yīng)用PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明1971年，1971年，美國(guó)麻省理工(MIT)教授、1968年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主Khorana提出：經(jīng)過(guò)DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過(guò)程便可克隆tRNA基因。但由于測(cè)序和引物合成的困難，以及且當(dāng)時(shí)(1970年)Smith等發(fā)現(xiàn)了DNA限制性內(nèi)切酶，使體外克隆基因成為可能，所以，使Khorana等的早期設(shè)想被人們遺忘……PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明1985年，美國(guó)PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（P

2、CR）；基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制；最初采用E-coliDNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過(guò)程耗時(shí)，費(fèi)力，且易出錯(cuò)；耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀；1993年，Mullis等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。KaryB.Mullis<>，1989年美國(guó)《Science》雜志列PCR為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首，比喻1989年為PCR爆炸年，Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。引物引物

3、Mullis的構(gòu)思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)40506070809010010080604020二、PCR的基本原理PCR基本原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。PCR的基本步聚1、變性(Denaturation)：通過(guò)加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA。2、退火(Annealing)：當(dāng)溫度突然降低時(shí)，反應(yīng)體系中引物和其互補(bǔ)的DNA模板在局部形成雜交鏈。3、延伸(Extension)：在DN

4、A聚合酶和4種脫氧核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)及Mg2+存在條件下，5’→3’的聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的DNA鏈延伸反應(yīng)。這種熱變性-復(fù)性-延伸的過(guò)程就是一個(gè)PCR循環(huán)，PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。72℃94℃55℃PCR循環(huán)(30-40)變性退火延伸PCR反應(yīng)程序PCR反應(yīng)程序PCRCycle-Step1-DenaturationTemplateDNAbyHeat(95℃)TargetSequenceTargetSequencePCR原理示意圖①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PC

5、R擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；5’3’3’5’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG5’3’3’5’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG加熱94℃引物酶②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；PCRCycle-Step2–Temperatureislowered(Tm)andprimersanne

6、altotargetsequencesTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’引物酶3’5’3’5’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG引物ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC引物3’5’5’3’PCRCycle-Step3-At72℃TaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporatedTargetSequenceTargetSequencePri

7、mer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈。3’5’3’5’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCDNA聚合酶TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGDNA聚合酶5’5’3’3’引物引物Endofthe1stPCRCycle–R