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1、PCR技術(shù)及其應(yīng)用生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)目錄PCR的反應(yīng)原理PCR的類型和應(yīng)用PCR示例多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR：PolymeraseChainReaction)KaryB.MullisPCR是由美國(guó)科學(xué)家穆利斯提出的一種體外簡(jiǎn)化條件下模擬DNA體內(nèi)復(fù)制的DNA快速擴(kuò)增的方法，此技術(shù)獲得1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。體內(nèi)DNA的復(fù)制體系DNA聚合酶（IIIIII）拓?fù)洚悩?gòu)酶解旋酶類SSB引物dNTPMg2+5’3’Mullis的PCR構(gòu)思引物引物DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)405060708090100100806040
2、20耐熱DNA聚合酶Saiki（1988）將耐熱DNA聚合酶引入PCR，使利用熱變性解鏈DNA模板可行。PCR反應(yīng)循環(huán)72℃94℃55℃PCR循環(huán)變性退火延伸PCR的指數(shù)擴(kuò)增（2n）引物延伸延伸5’5’3’3’變性、退火變性、退火變性、退火延伸TaqP1P2PCR反應(yīng)體系dATPdTTPdGTPdCTPMg2+模板：DNA引物：P1+P2DNA聚合酶：TaqE原料：dNTP反應(yīng)緩沖液10xBuffer輔助因子：Mg2+1）PCR反應(yīng)成分（1）模板單、雙鏈DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。DNA模板一般100ng/100?L。模板濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特
3、異性增加。PCR反應(yīng)條件（2）引物濃度0.1-0.5?mol/L濃度過(guò)高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配,反應(yīng)特異性下降。（3）TaqDNA聚合酶0.5-2.5U/50?l酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過(guò)少影響反應(yīng)產(chǎn)量。（4）dNTP（10mMor2.5mM）含四種核苷酸dATP、dGTP、dCTP、dTTPdNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度濃度過(guò)高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入,濃度過(guò)低則降低反應(yīng)產(chǎn)量dNTP可與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度下降,影響DNA聚合酶的活性。（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。濃度為0.5-2.5mmol/L。Mg2+濃度過(guò)低會(huì)使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2
4、+過(guò)高影響反應(yīng)特異性。Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合,所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。2）循環(huán)參數(shù)變性使雙鏈DNA解鏈為單鏈94℃，30-60秒(2)退火溫度由引物長(zhǎng)度和GC含量決定。增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。引物設(shè)計(jì)：（1)序列應(yīng)位于高度保守區(qū),與非擴(kuò)增區(qū)無(wú)同源序列。（2）引物長(zhǎng)度以15-40bp為宜。（3）堿基盡可能隨機(jī)分布,G+C占40-60%。（4）引物內(nèi)部避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。（5）兩引物間避免有互補(bǔ)序列。（6）引物3’端為關(guān)鍵堿基；5’端無(wú)嚴(yán)格限制。Tm=（G+C）x4+（A+T）x2（3）延伸70-75℃,一般
5、為72℃延伸時(shí)間由擴(kuò)增片段長(zhǎng)度決定（4）循環(huán)次數(shù)主要取決于模版DNA的濃度一般為25-35次次數(shù)過(guò)多：擴(kuò)增效率降低錯(cuò)誤摻入率增加PCR的應(yīng)用1、特定DNA片段（基因、調(diào)控序列）的鑒定、分離或制備。A、DNAB、cDNA2、基因表達(dá)分析（原位、離體）A、基因是否表達(dá)B、基因表達(dá)水平高低3、基因突變基因克?。ǎ遥裕校茫遥┠孓D(zhuǎn)錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜交雙鏈PCR擴(kuò)增1.細(xì)胞或組織固定：細(xì)胞經(jīng)固定和乙醇通透化處理后便適于一般PCR試劑（包括引物和Taq酶）進(jìn)入2.PCR擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)目的片段3.原位雜交檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物A.陽(yáng)性對(duì)照B.陰性對(duì)照C.原位檢測(cè)mRNA表達(dá)原位ＰＣＲ分析基因表達(dá)的組織特
6、異性熒光定量PCR（real-timePCR)分析基因表達(dá)水平通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤,實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程,結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析,計(jì)算待測(cè)樣品的初始模板量。內(nèi)摻式染料SYBRGreenI序列特異性探針TaqmanMolecularBeaconsDualProbes(FRET)引物特異性探針Amplifluor(Intergen)5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-GreenI反向PCR(reversePCR)擴(kuò)增已知序列兩側(cè)的未知序列用反向的互補(bǔ)引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段，對(duì)某個(gè)已知DNA
7、片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。未知序列未知序列已知序列已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀梯度PCR儀普通PCR儀1、材料：含0.3Kb插入片段的克隆載體2、儀器：微量移液器及吸頭、PCR儀及PCR管瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備3、試劑：10XPCR反應(yīng)緩沖液25mmol/LMgCl210mmol/LdNTP10μmol/L引物1和引物2二、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑1.反應(yīng)體系（50μl體系）：10
