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1、慢病毒載體的構(gòu)建－－Gatewaytolentiviralvector------獻(xiàn)給勇敢的斗士???????????????January2007Introduction慢病毒（Lentiviruses）屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科。慢病毒核蛋白質(zhì)前整合復(fù)合物具有噬核特性，病毒基因組運輸至細(xì)胞核，從而使慢病毒可以感染和在非有絲分裂細(xì)胞中復(fù)制。這一特性使慢病毒成為基因治療的轉(zhuǎn)移載體。HIV（Humanimmunodeficiencyvirus）、EIAV（Equineinfectiousanemiavirus）、FIV（Felineimmunodeficiencyvirus）、SIV（Simianimm
2、unodeficiencyvirus）。其中研究最多最為透徹的是HIV。Lentiviruseslifecycle慢病毒通過病毒衣殼糖蛋白與細(xì)胞膜上的特異受體結(jié)合而進(jìn)入易感靶細(xì)胞。一旦與細(xì)胞膜上的特異受體結(jié)合，慢病毒膜和細(xì)胞膜融合后病毒核心釋放入細(xì)胞漿里。病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄合成雙鏈線性DNA而轉(zhuǎn)運之細(xì)胞核。線性病毒DNA永久性的整合入染色體DNA（宿主基因組）中，形成前病毒，成為永久的遺傳成分，在細(xì)胞周期中與靶細(xì)胞基因一樣進(jìn)行復(fù)制，轉(zhuǎn)給子代細(xì)胞。前病毒DNA轉(zhuǎn)錄成RNA后再轉(zhuǎn)運至胞漿，在胞漿里RNA翻譯成病毒蛋白。病毒前結(jié)構(gòu)蛋白和復(fù)制酶與病毒RNA組裝成新的病毒核心，從包裝細(xì)胞獲得病毒包膜蛋白
3、后以出芽的方式從細(xì)胞膜上釋放出。病毒前結(jié)構(gòu)蛋白經(jīng)進(jìn)一步處理而最終形成成熟的具有感染性的子代病毒顆粒。這些特性是慢病毒成為基因治療轉(zhuǎn)運工具的重要原因。MitrophanousK,GeneTher5(11):1481–1487(1999)LentiviralVectorSystems UnderDevelopmentPrimateHumanimmunodeficiencyvirus(HIV)Simianimmunodeficiencyvirus(SIV)Non-primateFelineimmunodeficiencyvirus(FIV)Equineinfectiousanemiavirus(E
4、IAV)Theoutlineofthisppt接下來將以HIV為例從以下方面說明慢病毒載體構(gòu)建方面的基礎(chǔ)知識：一.HIV-1lifecycle二.HIV-1基因結(jié)構(gòu)和病毒顆粒結(jié)構(gòu)三.載體系統(tǒng)構(gòu)建的基本原理四.載體系統(tǒng)的設(shè)計五.包裝系統(tǒng)的設(shè)計-----HIV-1-Derivedlentiviralvectorproduction,concentration&titration1.HIV-1-Derivedlentiviralvectorproduction&titration2.HIV-1VectorProduction----Supernatantrecoveries&concentrat六
5、.ThedifferenceofPackagingCellsforLVVwithotherretroviruses七.TheDevelopmentofLVVectors八.AdvantagesandDisadvantagesofLentiviralvectors九.ThecomparisonofLentiviralvectorswithothervectors一HIV-1lifecycle二HIV-1基因結(jié)構(gòu)gag,-----群抗原基因，編碼核心蛋白p24pol-----多聚酶基因，編碼多聚酶；env-----包膜蛋白基因，編碼包膜蛋白gp120及gp41；tat-----基因反式激活因子對
6、HIV-1基因其正調(diào)控作用rev,-----病毒蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)因子，能增加gag和env基因?qū)Y(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)vif,-----病毒感染因子,其作用是在一些細(xì)胞因子的協(xié)下促進(jìn)HIV-1在細(xì)胞內(nèi)復(fù)Vpr,-----R蛋白能使HIV在巨噬細(xì)胞中增殖vpu,-----U蛋白，能促進(jìn)HIV從細(xì)胞膜上釋放nef,----負(fù)因子，具有抑制HIV-1增殖作用二HIV-1病毒顆粒結(jié)構(gòu)三載體系統(tǒng)構(gòu)建的基本原理HIV-1基因組中如包裝信號、長末端重復(fù)序列的順式作用元件與編碼反式作用蛋白的序列進(jìn)行分離。即從病毒基因組中將反式gag,pol,andenv基因(其他輔助基因省去)從病毒中分離出而用我們感興趣的外源性目的基
7、因代替，剩下的順式作用元件在病毒復(fù)制周期中------逆轉(zhuǎn)錄、整合、轉(zhuǎn)錄和包被--------可以被其它病毒或細(xì)胞蛋白識別。Fig.1慢病毒載體的順式作用元件四載體系統(tǒng)的設(shè)計慢病毒載體系統(tǒng)由三種不同的組成部分：包裝結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)移載體成分和包膜蛋白成分（Env表達(dá)結(jié)構(gòu)）。包裝部分由去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用元件的HIV-1基因組而構(gòu)建,能反式提供產(chǎn)生病毒顆粒所需的蛋白;載體部分與包裝成分互補(bǔ),僅含有包裝
