塞內(nèi)卡病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法.pdf

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1、ICS11.220B41團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/CVMAX7—2019塞內(nèi)卡病毒熒光RT-PCR檢測(cè)方法Real-timeRT-PCRassayfordetectionofSenecavirusA（征求意見(jiàn)稿）CVMA中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)2019-XX-XX發(fā)布2019-XX-XX實(shí)施中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)發(fā)布T/CVMAX7-2019前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)不涉及相關(guān)專(zhuān)利。本標(biāo)準(zhǔn)由中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：青島立見(jiàn)診斷技術(shù)發(fā)展中心、中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心。本標(biāo)準(zhǔn)起草人：張志、李陽(yáng)、

2、孫學(xué)強(qiáng)、劉爽、徐烽曄、王永玲、宮楓舉、官麗娟、邵鈺、李翠翠、李曉成、尼博、于曉慧、王琳、周曉翠。CVMA中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)-1-T/CVMAX7-2019塞內(nèi)卡病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了塞內(nèi)卡病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)的技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于塞內(nèi)卡病毒的核酸檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB1

3、9489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求3縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。3.1SVA：塞內(nèi)卡病毒（SenecavirusA）3.2實(shí)時(shí)熒光RT-PCR：實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-timeRT-PCR）3.3Ct（或Cp）值：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)量達(dá)到設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（Thresholdcycle）3.4FAM：羧基熒光素（Carboxyfluorescein）4儀器設(shè)備4.1熒光PCR檢測(cè)儀。4.2臺(tái)式冷凍離心機(jī)：可控溫至4℃、離心速度可達(dá)12000r/min以上。4.3普通冰箱：2℃~8

4、℃。CVMA4.4普通冰柜：中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)-20℃以下。4.5超低溫冰箱：可控溫至-70℃以下。4.6微量移液器：0.1μL~2.5μL、1μL~10μL、10μL~100μL、100μL~1000μL，并配備與移液器匹配的吸頭。4.7高壓滅菌鍋。5試劑和耗材5.1試劑5.1.1RNA提取試劑盒5.1.2SVA檢測(cè)引物和Taqman熒光探針，序列如下：上游引物qSVA-F：5’-CTGCGCTGGGACCGTATCTCA-3’下游引物qSVA-R：5’-CGCCGCGCCACCTCATT-3’-2-T/C

5、VMAX7-2019熒光探針qSVA-Probe：5’FAM-TCGCCGTAAGCGTGCACCGAGACAG-3'BHQ15.1.3陽(yáng)性對(duì)照：滅活的SVA病毒培養(yǎng)物或體外轉(zhuǎn)錄的cDNA。5.1.4陰性對(duì)照：為已知SVA陰性的豬的組織懸液。5.2耗材5.2.11.5mL離心管。5.2.20.2mLPCR薄壁管或八聯(lián)管。5.2.310-200μL帶濾芯吸頭。6樣品的采集、保存和運(yùn)輸6.1樣品的采集6.1.1水泡液采集典型臨床發(fā)病動(dòng)物水泡液用滅菌注射器吸出后裝入樣品保存管，加青鏈霉素各1000IU/mL，

6、加蓋封口，冷凍保存。6.1.2水泡皮采集用滅菌剪刀剪取水泡皮適量（1g~2g）裝入樣品保存管，加50%甘油-PBS保存液，使保存液液面沒(méi)過(guò)樣品，加蓋封口，冷凍保存。6.1.3全血或血清采集屠宰場(chǎng)豬的全血或血清直接用離心管接取不少于5mL，豬場(chǎng)豬只用無(wú)菌注射器抽取靜脈血不少于5mL，室溫或37℃放置自然凝集20min~30min，2000r/min~3000r/min離心10min，吸取上清液到新的離心管內(nèi)備用。6.1.4組織樣品采集取豬扁桃體、脾臟、淋巴結(jié)等主要臟器適量（5g~10g）裝入滅菌15mL樣

7、品管中，編號(hào)，備用。6.2樣品的保存上述采集的樣品可立即用于檢測(cè)，不能立即檢測(cè)的樣品，在2℃~8℃條件下不超過(guò)24h，-20℃可以短期保存，-70℃以下可以長(zhǎng)期保存。CVMA6.3樣品的運(yùn)輸中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)樣品的運(yùn)輸必須采用低溫保存進(jìn)行運(yùn)輸，并在規(guī)定溫度下的保存期內(nèi)送達(dá)。7實(shí)時(shí)熒光RT-PCR操作程序7.1樣品RNA提取用商品化的RNA提取試劑盒提取樣品的RNA，備用。提取的RNA應(yīng)立即進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增，如在4℃保存，不宜超過(guò)8h，如需長(zhǎng)期保存，應(yīng)放置在-70℃中冰箱中。7.2反應(yīng)體系的配置在反

8、應(yīng)配置區(qū)進(jìn)行。每個(gè)檢測(cè)反應(yīng)體系使用18μL的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)液，分別加入制備的RNA溶液2μL，使每管總體積達(dá)到20μL，編號(hào)，擰緊管蓋后，500r/min離心30s。7.3實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)在檢測(cè)區(qū)進(jìn)行。在熒光PCR儀上選用FAM通道，設(shè)置如下反應(yīng)參數(shù)：-3-T/CVMAX7-201942℃反轉(zhuǎn)錄15min，95℃變性3min，然后40個(gè)循環(huán)（95℃10s，60℃20s），60℃采集信號(hào)。8結(jié)果判定8.1閾值設(shè)定閾值設(shè)定原則