體外放射分析(檢驗)-檢驗核醫(yī)學

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1、第四章體外放射分析核醫(yī)學教研室教學目的掌握體外放射分析的原理（RIA、IRMA）掌握RIA與IRMA的異同掌握RIA、IRMA的基本操作程序掌握RIA、IRMA的基本試劑了解體外放射分析試劑的要求體外放射分析B與F的常見分離方法重難點重點：1、RIA、IRMA的原理2、RIA、IRMA的異同點難點：1、RIA的原理體外放射分析指在體外實驗條件下，以特異結合反應為基礎，以放射性測量為手段，對生物活性物質進行超微量分析的總稱。特點：靈敏度高、特異性強、精密度好、應用范圍廣、方法簡便。按反應機制分競爭性放射分析Competitiv

2、eradioassay非競爭性放射分析Non-Copetitiveradioassay一體外放射分析的概述（一）特異性結合1、抗原與抗體2、配體與受體3、底物與酶4、激素與血漿結合球蛋白（二）結合反應動力學規(guī)律[L]+[B]=[LB]1、競爭性結合分析[L]+[*L]+[B]=[LB]+[*LB]2、非競爭性結合分析Sp.Ab1+Ag=SpAb1.Ag+*Ab2=Sp.Ab1.Ag.*Ab2+*Ab2（三）放射性測量放射性測量是定量的基礎第一節(jié)放射免疫分析radioinnumoassay,RIA競爭放射分析放射免疫分析（Ra

3、dioImmunoAssay,RIA）競爭性蛋白結合分析（CompetitiveProteinBindingAssay,CPBA）放射受體分析（RadioReceptorAssay,RRA）[L]+[*L]+[B]=[LB]+[*LB]（一）放射免疫分析原理*Ag+Ag+Ab=(*Ag—Ab)+(Ag—Ab)+*Ag+Ag0MaxMin???條件：1、*Ag定量、足量2、Ab限量*Ag>Ab放射性計數(shù)[Ag]Ag與*Ag-Ab成反比！專用符號：1、T(Total):加入的*Ag的放射性計數(shù)2、B(Bound):*Ag—Ab免

4、疫復合物的放射性計數(shù)3、B0Ag=0時*Ag—Ab放射性計數(shù)4、F(Free):游離的*Ag的放射性計數(shù)T=B+F5、NSB(Non-specificbinding):非特異性結合產生的放射性計數(shù)6、結合率：B/T、B/B0、B/F*Ag+Ag+Ab=(*Ag—Ab)+(Ag—Ab)+*Ag+Ag不同坐標體系對應RIA劑量反應曲線（二）RIA的三種基本試劑標準品（Ag）標記物（*Ag）抗體（Ab）放射性免疫及免疫放射分析試劑盒1、標準品化學結構：應與被測物具有相同的化學結構化學純度：純品化學度量：準確穩(wěn)定性：保持生物活性不變

5、2、標記物要求：1、較高的比活度2、生物活性與免疫活性：與標記前一致3、放射化學純度：>95%4、穩(wěn)定性鑒定：1、最大結合率2、標準曲線比較法3、稀釋曲線比較法3、抗體要求：1、親和力2、高滴度3、特異性4、可長期保存抗體抗原動物選擇佐劑免疫動物、收獲鑒定抗體一、多克隆抗血清抗血清的鑒定親和力：指抗體與抗原的結合能力，常用平衡親和常數(shù)KA表示。特異性：抗體與相應抗原的結合能力與其它類似物結合能力的比較，常用交叉反應率（CrossReaction）表示交叉反應率=Y/Z×100%Y：標準抗原取代50%結合率所對應的濃度Z：類似

6、物取代50%結合率所對應的濃度滴度：結合50%標記抗原時血清的稀釋度單克隆抗體特點：特異性高抗體成分專一可反復制備制備：1、免疫小鼠，制備脾細胞懸液2、選擇培養(yǎng)，用HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細胞3、檢測抗體4、克隆化（三）分離方法1、分離方法的要求1、使結合部分與游離部分盡可能完全分開2、分得的成分便于作放射性操作3、分離效果不受外界干擾因素影響4、操作簡便、分離迅速、重復性好5、試劑來源廣泛、價廉易得2、常用的分離方法聚乙二醇法（PEG）活性炭吸附法鹽析法微孔濾膜法雙抗體法SPA法固相抗體法：塑料、纖維素、凝膠顆粒、多孔玻璃微

7、球磁化顆粒法非特異性分離方法特異性分離方法（四）放射免疫分析方法的建立1、反應方式平衡法順序加樣法STAT法2、加樣程序實驗設計配制試劑加未標記物（標準品或待測樣品）加標記物（*Ag）加抗體（Ab）混勻、溫育加分離劑、分離B與F測量各管放射性計數(shù)，繪制標準曲線由標準曲線反求出樣品濃度第二節(jié)、免疫放射分析（ImmunoradiometricAssay,IRMA）一、IRMA的原理及方法學單位點系統(tǒng)雙位點系統(tǒng)標記第三抗體法雙標記抗體法1、單位點系統(tǒng)：[Ag]放射性計數(shù)Ag與Ag-*Ab成正比！2、雙位點系統(tǒng)用抗原的二株單克隆抗體

8、，一株制備固相抗體（●·Ab1）與標準品或待測樣品中的抗原（Ag）結合反應，加入另一株制備標記的抗體（*Ab2），最終結合形成固相抗體—抗原—標記抗體（Im-Ab·Ag·*Ab）復合物，剩余的標記抗體（*Ab）呈游離液態(tài)被分離?！瘛b1+Ag●·Ab1.Ag+*Ab2●·Ab1·Ag·*