心肌細(xì)胞培養(yǎng)

《心肌細(xì)胞培養(yǎng)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。

1、乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)談1.心肌細(xì)胞搏動(dòng)差，収材后2、3天細(xì)胞活力明顯下降：胰酶+膠原酶II混合消化的方法，并且每次消化前都輕柔的吹打讓組織充分和消化液混合，消化后也充分吹打后靜置1—2分蝕再吸上清，最后離心完成后，用培養(yǎng)基重懸沉淀是要充分吹打，以避免再下一步過濾時(shí)大量的丟失細(xì)胞。還要保證種板的密度，一般24孔板我們用2.5x105,每孔1ml,這樣24h后就可以很漂亮的看到細(xì)胞搏動(dòng)了，一-般72h后搏動(dòng)就是統(tǒng)一的頻率了。經(jīng)驗(yàn)一：總結(jié)來說：1.0.08%膠原酶11+0.125%胰酶等比混合后消化2消化前后一定要輕柔吹打3.重懸時(shí)要充分吹打，動(dòng)作輕柔（100次）4.種板密度要合

2、適5.當(dāng)然血清，板都要進(jìn)口，別圖便宜6.別忘了檢查CO2溫箱的情況2.消化吋總是出現(xiàn)凍凍狀東西啊，吸時(shí)會(huì)把組織快吸走：膠凍樣的東西應(yīng)該是組織間未消化掉的膠原吧，或消化后的碎細(xì)胞DNA.用DNA酶消化后就沒了。經(jīng)驗(yàn)二：1：首先是選擇乳鼠時(shí)最好是出生3天內(nèi)的，活力是較好的，皮膚看起來是暗紅色的，再大一點(diǎn)的話，皮膚變厚，變白，不過也能養(yǎng)活，而且1個(gè)25CM2的培養(yǎng)瓶3只足夠了，當(dāng)然這里說的是SD的。2:胰酶加膠原酶消化，消化過程中出現(xiàn)絮狀物，可能是消化有些快了，處理：如果樣品足夠多就可以將Z丟去；樣品少的話，可以先將所有的樣品吸入另一新的離心管，重新在這個(gè)管字消化，將細(xì)胞懸液用5

3、%血清培養(yǎng)液中止消化，而且一定得盡快中止，離心后再中止一次即可。離心1000轉(zhuǎn)4分鐘.3:四季清的胎牛血清,180元一瓶，很便宜,進(jìn)口的沒用過，我們隔壁有人用2000元一瓶.這個(gè)和老板有沒有錢有關(guān)系，要是有錢，我建議用進(jìn)口的?我們用的是15%的濃度.（注意:終止液和培養(yǎng)液濃度是不同的，終止液沒必要用那么高濃度，有點(diǎn)浪費(fèi)），我們用高糖的DMEM,感覺不錯(cuò).在這里我感覺最重要的培養(yǎng)液的PH值,盡量在7.2-7.4Z間，剛開始我們還有儀器測,后來就觀察顏色了,覺得不行就用HCL或NAOH調(diào)，大部是高，沒有低的.所以NAOH沒有用過.4:離心管和瓶最好是用進(jìn)口的，還要差速貼壁.細(xì)胞

4、接種的濃度最好高些庁可浪費(fèi)一些.也不要讓濃度太低，低了不容易活?這個(gè)本人覺得可能是細(xì)胞之間會(huì)產(chǎn)生某些刺激生長的東西，再說了，不管濃度高低肯定會(huì)有一些死細(xì)胞存在的，死的細(xì)胞對活細(xì)胞的生長也是有害的，所以盡量接種濃度要高些。心肌細(xì)胞培養(yǎng)最好的培養(yǎng)基相關(guān)問題討論總結(jié)乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基可以用EMEM,MEM,DMEM,M199,MCDB107液,DMEM/F12液,其中以DMEM/F12液最佳，ph值為7.Z7.4。DMEM/F12養(yǎng)原代心肌，依賴于開始養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)。DMEM/F12可能開始會(huì)使細(xì)胞狀態(tài)可以，提前撥動(dòng)，但也會(huì)讓細(xì)胞提前老化，所以很難控制最佳狀態(tài)，提高血清會(huì)提高細(xì)

5、胞的貼壁率，當(dāng)然也會(huì)帶來成纖維的干擾，事實(shí)上有點(diǎn)成纖維，心肌會(huì)長的更好。HG-dmem+10%FBS養(yǎng)，感覺狀態(tài)比較好控制，次日下午就可以看到跳動(dòng)，第三天同步搏動(dòng)就可以開展實(shí)驗(yàn)了，之后細(xì)胞呈老態(tài)化，數(shù)目減少，成聚，個(gè)個(gè)像個(gè)會(huì)搏動(dòng)的向日葵。原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)（不用膠原酶并且消化次數(shù)不多）主要用品:WISTAR乳鼠，出生2天6只一把彎攝，兩把剪子，200目濾網(wǎng)，康寧塑料培養(yǎng)瓶，冰臺(tái)髙糖DMDM（HYCLONE）,四季青胎牛血清（10%）,sigma胰酶（1：250,0.25%,PBS配制，PH約7.0）,國產(chǎn)BRDU1.用灑精棉擦干凈乳鼠后拿入超凈臺(tái)，再將鼠放入灑精中泡幾秒后拿出

6、，用眼科剪在胸骨左側(cè)約笫6肋間剪開胸骨（不要剪開腹腔），心臟可跳出，在收縮時(shí)剪下，放入含預(yù)冷的PBS平皿內(nèi)（置于冰臺(tái)上），用灑精棉擦凈剪子上的血跡過火后處理下一只。2剪除心臟上的大血管心房部分，將心室肌移入另一裝有預(yù)冷PBS的平皿內(nèi)，每個(gè)心臟剪成兩半，在PBS里洗干凈，移入另一小燒杯內(nèi)，剪成0.5-1mm3小塊，PBS沖洗3次1.加入預(yù)熱胰酶5ML,轉(zhuǎn)移入50毫升離心管內(nèi)，用3ML-次性吸管（短粗口的）軟柔吹打2?3次，放入37度培養(yǎng)箱（無CO2）中，每2分鐘振搖一次，5分鐘后拿出，在超凈臺(tái)內(nèi)吹打100次，沉淀一會(huì)后棄上清2.再加入5ML胰酶置離心管內(nèi)，重復(fù)步驟3,將此次上

7、清放入預(yù)先分裝的5ML完全培養(yǎng)基（10%FBS高糖DMEM）,吸管吹打液體100次充分混均而且?guī)氲纳倭拷M織塊也可分散，放入4度冰箱中，（除第一次棄上清外，再消化3?4次便可消化完全）3.將收集的上清液于200目濾網(wǎng)過濾后離心（1100轉(zhuǎn)5MIN,離心機(jī)半徑約15CM）,重懸，分2個(gè)25CM2的培養(yǎng)瓶中，差速貼1.5小時(shí)，用瓶內(nèi)的培養(yǎng)液輕輕吹瓶壁2次，轉(zhuǎn)移到另外2個(gè)培養(yǎng)瓶內(nèi)，力05-BRDU（終濃度0.1MMOL/L）6.48小時(shí)換液,可同步搏動(dòng)，（只有細(xì)胞Z間可以連接的時(shí)候才會(huì)同步搏動(dòng)，細(xì)胞數(shù)少時(shí)就自已跳自己的）