擬南芥T-DNA插入突變體的鑒定

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1、遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告擬南芥T-DNA插入突變體的鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、學(xué)習(xí)和掌握基本的植物DNA的CTAB提取法，掌握PCR、瓊脂糖凝膠電泳等基本實(shí)驗(yàn)操作技能2、了解T-DNA插入突變體的鑒定原理，掌握其方法。二、實(shí)驗(yàn)原理1、擬南芥（Arabidopsisthaliana）十字花科，植物遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和分子生物學(xué)的模式植物。?植株形態(tài)個(gè)體小，高度只有30cm左右；?生長周期快，從播種到收獲種子一般只需8周左右；?種子多，每株可產(chǎn)生數(shù)千粒種子；?形態(tài)特征簡單，生命力強(qiáng)，用普通培養(yǎng)基就可作人工培養(yǎng)；?遺傳轉(zhuǎn)化簡單，轉(zhuǎn)化效率高；?基因組小，只

2、有5對染色體，125MB；?在2000年，擬南芥成為第一個(gè)基因組被完整測序的植物。2、突變體突變體是遺傳學(xué)研究的最重要材料。突變體可以通過自然突變和人工誘變的方法獲得。擬南芥誘變常用方法有EMS誘變、T-DNA插入突變、激活標(biāo)簽。由于T-DNA插入突變體便于對突變基因進(jìn)行追蹤，目前擬南芥、水稻中已經(jīng)有大量的T-DNA插入突變體；SALK中心提供的擬南芥T-DNA插入突變體超過十萬種。3、T-DNA插入突變原理T-DNA，轉(zhuǎn)移DNA（transferredDNA），是根瘤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒中的一段DNA序列，可以從農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)移并穩(wěn)定整合到植

3、物基因組。人們將目的基因插入到經(jīng)過改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實(shí)現(xiàn)外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與整合，獲得轉(zhuǎn)基因植株。除用于轉(zhuǎn)基因以外，T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活，從而產(chǎn)生基因敲除突變體，T-DNA大多為單拷貝插入，使其利于進(jìn)行遺傳分析。4、T-DNA插入突變體PCR鑒定圖1結(jié)果鑒定圖2PCR引物設(shè)計(jì)三、實(shí)驗(yàn)材料1、材料：T-DNA插入的突變擬南芥植株；2、儀器：離心管，離心機(jī)，水浴鍋，移液槍，PCR儀，電泳槽等；3、試劑：液氮，CTAB提取液，氯仿/異戊醇（24：1），無水乙醇，70%乙醇，10xTaqbuff

4、er，MgCl2，引物，瓊脂糖，溴化乙錠（EB）。四、實(shí)驗(yàn)步驟1、植物DNA提取方法（CTAB法）1)水浴加熱CTAB提取液至65℃；2)取葉片100mg,液氮研磨成粉末；3)加入600μlCTAB提取液并混勻；4)65℃水浴45min（至少30min）；5)12,000rpm離心10min；6)將上清轉(zhuǎn)移到新離心管，加入等體積氯仿/異戊醇,混勻；7)12,000rpm離心5-10min,將上清液轉(zhuǎn)移到新管中；8)向上清中加入1/10體積3MNaAc,再加入預(yù)冷的等體積異丙醇或2V無水乙醇,混勻冰上放置10min；9)12,000rp

5、m離心10min，棄上清，加入500μl70％乙醇洗滌2min；10)12,000rpm離心5min，棄上清，吸干殘留并干燥；11)加20-50μlTE緩沖液溶解DNA。2、PCR反應(yīng)1)引物設(shè)計(jì)?LP:5’-TCATCCACCATGGAAGAAAAG?RP:5’-TTGGATACGATGCGAGTAAAC?BP:5’-TTGTTCACGTAGTGGGCCATCG?LP+RP:1107bp?BP+RP:560-860bp2）PCR反應(yīng)體系?H2O:12.4μl?10×Buffer:2μl?dNTP:0.5μl?MgCl2:2μl?LP

6、/BP:0.5μl?RP:0.5μl?Taq:0.1μl?DNA:2μl?Total:20μl3)PCR溫度設(shè)定?94℃5min?33cyclen變性：94℃30sn退火：53℃30sn延伸：72℃1min30s?72℃7min3、瓊脂糖凝膠電泳分析1)500-1000bp：1.2%，Agarose0.5×TBE；2)化膠時(shí)應(yīng)注意不能沸出，冷卻至約60℃制膠，凝膠充分冷卻凝固后點(diǎn)樣進(jìn)行電泳；3)PCR產(chǎn)物加3-4μl6×loadingbuffer；4)120V穩(wěn)壓電泳；5)EB染色10min，紫外觀察。五、結(jié)果分析PCR產(chǎn)物電泳截圖結(jié)

7、果如下圖所示。12345678910111213圖3PCR產(chǎn)物電泳條帶圖在圖3，第7泳道為DL2000DNAmarker，第5泳道是BP-RP引物體系，第六泳道是LP-RP引物體系。BP-RP體系的PCR產(chǎn)物產(chǎn)生一條略大于750bp的DNA條帶，而LP-RP引物體系中沒有在大致900bp的位置產(chǎn)生條帶。由此，可以斷定此樣品為純和突變體。六、思考與討論1、加液氮碾磨葉片時(shí)，最好保持離心管中始終有液體氮存在，如果碾磨一段時(shí)間后中途要加液氮繼續(xù)碾磨，一定注意，液氮沸騰時(shí)極易將已經(jīng)碾磨好的葉片吹走；另一點(diǎn)，碾磨時(shí)要迅速，避免空氣中的水汽在離心

8、管上凝結(jié)。本次試驗(yàn)中，離心管出現(xiàn)了冰霜，可能對最后的結(jié)果有影響。2、DNA有一定的物理脆性，所以在提取過程中混勻時(shí)一定要緩慢的搖晃，切忌劇烈震蕩。3、加液氮碾磨時(shí)，注意不要將葉片擠到離心管的底部，那樣會導(dǎo)致碾磨不充分。遇