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《T-DNA插入鑒定實(shí)驗(yàn)報(bào)告》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、T-DNA插入突變體的鑒定時(shí)明輝同組者：薛敏學(xué)號(hào)：201000220069摘要Ti質(zhì)粒是上有一段特殊的DNA區(qū)段，當(dāng)農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，該DNA區(qū)段能自發(fā)轉(zhuǎn)移進(jìn)植物細(xì)胞，并插入植物染色體DNA中。所以Ti質(zhì)粒上的這一段能轉(zhuǎn)移的DNA被叫做T-DNA。將感興趣的基因改造插入到T-DNA區(qū)段中，通過農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)外源基因?qū)χ参锏倪z傳轉(zhuǎn)化，得到含有突變的植株。通過本實(shí)驗(yàn)，我們將學(xué)習(xí)如何用PCR的方法檢測所得植株是否為T-DNA的插入突變體。1.引言T-DNA作為一種實(shí)驗(yàn)常用的遺傳轉(zhuǎn)化方法，在插入突變過程中，插入
2、到植物染色體上的位置是隨機(jī)的。如果T-DNA插入進(jìn)某個(gè)功能基因的內(nèi)部，特別是插入到外顯子區(qū)，將造成基因功能的喪失。所以利用農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，是獲得植物突變體的一種重要方法。農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞后，在獲得的后代分離群體中，有T-DNA插入的純合突變體，雜合突變體，和野生型。在突變體研究中，需要的材料是純合突變體，所以必須從分離群體中將純合突變體鑒定出來。本次實(shí)驗(yàn)中，采用液CTAB（或者TSP法）提取擬南芥植株的DNA，然后PCR將所獲DNA擴(kuò)增，在之后采用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)，分離處長度不一的DNA帶，以
3、確定樣品是否為T-DNA插入突變純和體。PCR（PolymeraseChainReaction），即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是體外核算擴(kuò)增技術(shù)，具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)；能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷。（PCR基本原理如右圖）DNA含有PO43-基團(tuán)，在pH8.0Buffer（本實(shí)驗(yàn)中為TAE）中帶負(fù)電,在電場中向正極移動(dòng)。自由電泳時(shí)，由于不同大小的DNA片段的電荷密度大致相同，各核酸分子難以分開；選用適當(dāng)濃度的瓊
4、脂糖凝膠作為支持物，使之具備一定的孔徑，即可發(fā)揮分子篩效應(yīng)，使大小不同的核酸片段遷移率出現(xiàn)較大差異，達(dá)到分離的目的；同樣條件對(duì)Marker電泳；起到鑒定的作用。不同濃度的瓊脂糖凝膠對(duì)應(yīng)線狀DNA分子分離范圍不同。（如下圖）2.實(shí)驗(yàn)材料試驗(yàn)材料待檢測擬南芥植株，我們組選的是18號(hào)擬南芥苗；實(shí)驗(yàn)試劑液氮，CTAB提取液，氯仿/異戊醇（24:1），無水乙醇，70%的乙醇，TE；引物（Lp、Rp、Bp），反應(yīng)緩沖液，dNTP，ddH2O，耐熱聚合酶；瓊脂糖，TAE緩沖溶實(shí)驗(yàn)器材離心機(jī)，恒溫槽，PCR儀，電泳儀，電子天平，冰塊
5、；離心管（0.2ml、0.5ml），移液槍等必要的實(shí)驗(yàn)器材。3.實(shí)驗(yàn)步驟3.1CTAB法提取DNA（1）用液氮100mg幼嫩葉片研磨成細(xì)粉，置于1.5ml離心管中加入預(yù)熱至65℃的600μl的2×CTAB提取液，輕搖混勻。（2）65℃水浴30min，其間輕搖混勻。（3）向上清液加入等體積的氯仿/異戊醇（24：1），室溫下輕輕混勻10min，12000rpm離心15min，再轉(zhuǎn)移上清液入新管。（4）向上清液中加入2倍無水乙醇或等體積的異丙醇，小心混勻，-20℃下30min，12000rpm離心15min，棄上清。（5）
6、用70%乙醇洗滌沉淀一次，12000rpm稍離心，棄上清。（6）將沉淀晾干，加20-50μlTE(pH8.0)，65℃水浴30min溶解DNA。3.2PCR步驟：（1）配置反應(yīng)體系：主要包括DNA模板，引物，反應(yīng)緩沖液，dNTP，ddH2O，耐熱聚合酶。（2）25ul體系：ddH2O16ul，緩沖溶液2.5ul，鎂離子2ul，dNTP0.5ul，引物1ul，DNA模板2ul，taq酶0.2ul。20ul體系：H2O13ul，10xTaqbuffer（含MgCl2)2ul，引物L(fēng)P(10uM)1ul，引物RP(10uM
7、)1ul，引物BP(10uM)1ul，dNTP(各2.5mM)1ul，模板DNA(30-50ng/μl)1ul，Taq酶(5U/μl)1ul。（3）配好體系，輕搖混勻，4000rpm離心10秒鐘。（4）設(shè)定反應(yīng)程序：1)預(yù)變性：94℃，5min；2)循環(huán)部分：變性解旋94℃，40sec；退火53℃，50sec；延伸72℃，80sec，循環(huán)35次；3)延伸部分：72℃，10min；4)保存：4℃下可以保存1-2天。3.3瓊脂糖凝膠電泳（1）配置40ml1.2%的瓊脂糖凝膠：稱取0.489g的瓊脂糖放入錐型瓶中，加入40
8、ml TAE加熱使其溶解，注意不要使其暴沸；（2）將加熱溶解的瓊脂糖凝膠稍冷卻，大約到50℃，將所得溶液移入瓊脂糖槽中，使之冷卻成型；（3）將冷卻凝固的瓊脂糖凝膠放入電泳槽中，加入TAE電極緩沖緩，直到液體稍浸沒凝膠；（4）向所得的25ulPC體系中加入5ul6×loadingbuffer，輕搖混勻；（5）以此向點(diǎn)樣空中滴加樣品，markerD
