凝膠滲透層析法

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1、凝膠滲透層析法溴酚藍(lán)Kav值的測(cè)定一、什么是凝膠滲透層析法是利用凝膠把分子大小不同的物質(zhì)分離開來(lái)的一種層析法分子篩層析法(molecularsievechromatography)排阻層析法（exclusionchromatography）二、什么是凝膠凝膠是由一些鏈狀有機(jī)物質(zhì)單體借助共價(jià)交聯(lián)劑在鏈間形成共價(jià)交聯(lián)使之聚合而成的有機(jī)高分子聚合物，其結(jié)構(gòu)為立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠層析法常用的天然凝膠是瓊脂糖凝膠（agarosegel，商品名Sepharose），人工合成的凝膠是聚丙烯酰胺凝膠（商品名為Bio-gel-P）和葡聚糖凝膠（dextran，

2、商品名稱為Sephadex）葡聚糖凝膠基本骨架是葡萄糖，葡萄糖通過(guò)1，6-糖苷鍵連接成鏈狀單體，再由3-氯-1，2-環(huán)氧丙烷作為交聯(lián)劑，將鏈狀結(jié)構(gòu)連接成立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔的大小可以通過(guò)調(diào)節(jié)交聯(lián)劑和葡萄糖的比例，反應(yīng)條件來(lái)控制交聯(lián)劑分子越多，交聯(lián)度越高，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中網(wǎng)絡(luò)間孔隙的孔徑越小三、原理將凝膠顆粒在適宜的溶劑中浸泡，使之充分吸液膨脹，然后裝入層析柱中，加入欲分離的混合物后，再以同一溶劑洗脫。在洗脫過(guò)程中，大分子不能進(jìn)入凝膠顆?？紫兜膬?nèi)部而沿凝膠顆粒間的縫隙最先流出柱外，小分子則可以進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，流速緩慢，最后流出柱外，從而使樣品中分子大

3、小不同的物質(zhì)得到分離。1.概述圖1凝膠層析的原理為了說(shuō)明凝膠層析的原理，將凝膠裝柱，柱床體積稱為“總體積”，以Vt（totalvolume）表示。實(shí)際上Vt是由V0、Vi與Vg三部分組成，即：Vt=V0+Vi+VgV0稱為“孔隙體積”或“外體積”（outervolume）又稱“外水體積”Vi為內(nèi)體積（innervolume）又稱“內(nèi)水體積”Vg為凝膠本身體積2.Kd●洗脫體積（Ve，elutionvolume）與V0及Vi之間的關(guān)系可用下式表示：Ve=V0+KdViKd為樣品組分在兩相間的分配系數(shù)。它只與被分離物質(zhì)分子的大小和凝膠顆?？紫?/p>

4、的大小分布有關(guān)，而與柱的長(zhǎng)短粗細(xì)無(wú)關(guān)它對(duì)每一物質(zhì)是常數(shù)，與柱的物理?xiàng)l件無(wú)關(guān)，可通過(guò)實(shí)驗(yàn)求得●當(dāng)Kd=0時(shí)，則Ve=V0。即對(duì)于根本不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部的大分子物質(zhì)（全排阻），洗脫體積等于空隙體積3.Kd值的三種情況：●當(dāng)Kd=1時(shí)，Ve=V0+Vi。即小分子完全可以滲入凝膠內(nèi)部時(shí)，洗脫體積應(yīng)為空隙體積與內(nèi)部體積之和●當(dāng)0＜Kd＜1時(shí)，Ve=V0+KdVi。即表示內(nèi)部體積只有一部分可被組分利用，擴(kuò)散滲透，Ve即在V0與Vi之間變化●有時(shí)Kd＞1，表示凝膠對(duì)組分有吸附作用，此時(shí)Ve＞V0+Vi4.Kd測(cè)定Kd可通過(guò)實(shí)驗(yàn)求得Ve為實(shí)際測(cè)得的洗脫體積

5、Vo可以是不被凝膠滯留的大分子物質(zhì)的洗脫體積,如分子量約200萬(wàn)的蘭色葡聚糖-2000Ve－VoKd=ViVi可由干凝膠顆粒重量和吸水量求得：Vi=g·WrVe的計(jì)算:嚴(yán)格講，要根據(jù)上樣量決定A←Ve→0Ve上樣體積小時(shí)，從加樣時(shí)算起（上樣體積忽略不計(jì)）至溶質(zhì)峰頂止←Ve→A0Ve上樣體積中等時(shí)，從上樣量的一半算起，上樣體積溶質(zhì)峰頂止上樣體積大時(shí)，因洗脫溶質(zhì)峰出現(xiàn)坪區(qū),上樣體積要從加樣時(shí)算起，至溶質(zhì)峰前緣最大峰高一半出現(xiàn)為止，此期間所流出的體積為該物質(zhì)的Ve半峰高1/21/2VeVeI、VeII、VeIII：分別表示三部分樣品的洗脫體積。

6、若樣品Ⅰ為藍(lán)葡聚糖2000等大分子物質(zhì)，則VeI既表示樣品Ⅰ的洗脫體積亦表示外水體積Vo。以---示洗脫曲線：表示上樣量小時(shí)洗脫曲線，此時(shí)溶質(zhì)峰峰頂及后緣位置均與上樣量較多時(shí)不同。半峰高加樣并開始洗脫VeII1/21/20半峰高VeII11ⅡⅢKav（有效分配系數(shù)）Kd=（Ve—V0）ViKav=（Ve—V0）（Vt—V0）Vt可利用量筒測(cè)量簡(jiǎn)便地得出Ve與分子量的關(guān)系對(duì)同一類型的化合物，洗脫特性與組分的分子量有關(guān)，流過(guò)凝膠柱時(shí)，按分子量大小順序流出，分子量大的走在前面，Ve與分子量的關(guān)系可用下式表示Ve=K1—K2LogM選擇曲線：以K

7、av對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作圖得一曲線每一類型的化合物都有它自己的特殊的選擇曲線?？捎靡詼y(cè)定未知物的分子量，測(cè)定時(shí)以使用曲線的直線部分為宜。四、影響凝膠層析的因素凝膠的選擇分離程度主要取決于凝膠顆粒內(nèi)部孔隙的孔徑和混合物分子量的分布范圍這兩個(gè)因素凝膠型號(hào)得水值（Wr克）交聯(lián)度排阻下限sephadexG-252.55000sephadexG-505.010000sephadexG-757.550000凝膠粒度對(duì)分離效果的影響凝膠的粒度分為三級(jí)：40~60目屬粗粒；100~200目屬中粒(細(xì)粒)；200~400目屬細(xì)粒(最細(xì)粒)中粒應(yīng)用較多，因?yàn)樗?/p>

8、使洗脫曲線的峰區(qū)變得對(duì)稱和狹窄。粗粒凝膠能使色帶散寬，且彼此重疊。過(guò)細(xì)的凝膠，因洗脫阻力大，會(huì)延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)間。洗脫流速對(duì)分離效果的影響一般流速為30~200ml/hr.，即0.5~3.5ml/m