葡聚糖凝膠層析法

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1、實(shí)驗(yàn)一蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定——凝膠層析法；一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?.掌握凝膠層析的基本原理；2.學(xué)習(xí)利用凝膠層析法測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的實(shí)；二、實(shí)驗(yàn)原理；凝膠層析法也稱分子篩層析法，是利用具有一定孔徑大；將凝膠裝在柱后，柱床體積稱為“總體積”，以Vt表；式中Ve為洗脫體積，自加入樣品時(shí)算起，到組分最大；上式中Ve為實(shí)際測(cè)得的洗脫體積；Vo可用不被凝膠；如果假定蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)一蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定——凝膠層析法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握凝膠層析的基本原理。2.學(xué)習(xí)利用凝膠層析法測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)技能。二、實(shí)驗(yàn)原理凝膠層析法也稱分子篩

2、層析法，是利用具有一定孔徑大小的多孔凝膠作固定相的層析技術(shù)。當(dāng)混合物隨流動(dòng)相經(jīng)過(guò)凝膠層析柱時(shí)，其中各組分按其分子大小不同而被分離的技術(shù)。該法設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、重復(fù)性好、樣品回收率高。凝膠是一種不帶電的具有三維空間的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、呈珠狀顆粒的物質(zhì)，每個(gè)顆粒的細(xì)微結(jié)構(gòu)及篩孔的直徑均勻一致，像篩子，小的分子可以進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔，而大的分子則排阻于顆粒之外。當(dāng)含有分子大小不一的蛋白質(zhì)混合物樣品加到用此類凝膠顆粒裝填而成的層析柱上時(shí)，這些物質(zhì)即隨洗脫液的流動(dòng)而發(fā)生移動(dòng)。大分子物質(zhì)沿凝膠顆粒間隙隨洗脫液移動(dòng)，流程短，移動(dòng)速率快，先被洗

3、出層析柱；而小分子物質(zhì)可通過(guò)凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入顆粒內(nèi)部，然后再擴(kuò)散出來(lái)，故流程長(zhǎng)，移動(dòng)速度慢，最后被洗出層析柱，從而使樣品中不同大小的分子彼此獲得分離。若分子大小介于上述完全排阻或完全滲入凝膠的物質(zhì)，則居二者之間從柱中流出?？傊?，各種不同相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)分子，最終由于它們被排阻和擴(kuò)散的程度不同，在凝膠柱中所經(jīng)過(guò)的路程和時(shí)間也不同，從而彼此可以分離開來(lái)。將凝膠裝在柱后，柱床體積稱為“總體積”，以Vt表示。實(shí)質(zhì)上Vt是由Vi與Vg三部分組成，Vo稱為“孔隙體積”或“外水體積”，即存在于柱床內(nèi)凝膠顆粒外面空隙之間的水相體積，相應(yīng)

4、于一般層析法中柱內(nèi)流動(dòng)相的體積；Vi為內(nèi)體積，即凝膠顆粒內(nèi)部所含水相的體積。Vg為凝膠本身的體積。洗脫體積（Ve）與Vo與Vi之間的關(guān)系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi式中Ve為洗脫體積，自加入樣品時(shí)算起，到組分最大濃度（峰）出現(xiàn)時(shí)所流出的體積；Kd為樣品組分在二相間的分配系數(shù)，也可以說(shuō)Kd是分子量不同的溶質(zhì)在凝膠內(nèi)部與外部的分配系數(shù)。它只與被分離的物質(zhì)分子的大小和凝膠顆粒孔隙的大小分布有關(guān)，而與柱的長(zhǎng)度粗細(xì)無(wú)關(guān)，也就是說(shuō)它對(duì)每一物質(zhì)為常數(shù)，與柱的物理?xiàng)l件無(wú)關(guān)。Kd可通過(guò)實(shí)驗(yàn)求得，上式可以改寫為:Kd=(Ve-Vo)/

5、Vi上式中Ve為實(shí)際測(cè)得的洗脫體積；Vo可用不被凝膠滯留的大分子物質(zhì)的溶液（最好是有顏色以便于觀察，如血紅蛋白，印度黑墨水，分子量約200萬(wàn)的藍(lán)色葡聚糖-2000等）通過(guò)實(shí)際測(cè)量求得；Vi可由g×Wr求得（g為干膠重量，單位為克；Wr為凝膠的“吸水量”，以毫升每克表示）。因此，對(duì)一層析柱膠床來(lái)說(shuō)，只要通過(guò)實(shí)際實(shí)驗(yàn)得知某一物質(zhì)的洗脫體積就可算出它的Kd值。如果假定蛋白質(zhì)分子近于球形，同時(shí)沒(méi)有顯著的水合作用，則不同大小分子量的蛋白質(zhì)，在洗脫時(shí)峰的位置和該物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量有直接的定量的關(guān)系。在一根凝膠柱中，凝膠顆粒間空隙所含水

6、相體積為外水體積Vo，不能進(jìn)入凝膠孔徑的那些大分子，當(dāng)洗脫體積為時(shí)Vo，出現(xiàn)洗脫峰。凝膠顆粒內(nèi)部孔穴的總體積為內(nèi)水體積Vi，能全部滲入凝膠的那些小分子，當(dāng)洗脫體積為Vo+Vi時(shí)，出現(xiàn)洗脫峰。Ve與分子量的關(guān)系：對(duì)同一類型的化合物，洗脫特性與組分的分子量有關(guān)，流過(guò)凝膠柱時(shí)，按分子量大小順序流出，分子量大的走在前面。Ve與分子量的關(guān)系可用下式表示：Ve=K1-K2logM,式中M為相對(duì)分子質(zhì)量，K1和K2為常數(shù),Ve也可用Ve-Vo。葡聚糖凝膠有不同的型號(hào)，用于分離不同相對(duì)分子質(zhì)量大小的物質(zhì)。例如SephardexG-75的

7、分級(jí)范圍是3000-80000的球形分子。在本實(shí)驗(yàn)中用于分離藍(lán)色葡聚糖和牛血清蛋白、胃蛋白酶、CytC。三、儀器和試劑儀器:層析柱核酸蛋白檢測(cè)器（或紫外分光光度計(jì)）、自動(dòng)部分收集器、刻度管試劑:藍(lán)色葡聚糖2000、SephardexG-75、洗脫液：0.2mol/LTris-HCL-KCL,PH7.5待測(cè)樣品:藍(lán)色葡聚糖、牛血清蛋白、胃蛋白酶、CytC四、實(shí)驗(yàn)步驟1．凝膠溶脹凝膠顆粒要求大小比較均勻，可流速穩(wěn)定，結(jié)果較好。取葡聚糖SephardexG-75干粉，加過(guò)量的蒸餾水室溫充分溶脹一天（溶脹時(shí)間因凝膠交聯(lián)度不同而不

8、同），或沸水浴中溶脹3小時(shí)，這樣可大大縮短溶脹時(shí)間，而且可以殺死細(xì)菌和霉菌，并可排出凝膠內(nèi)氣泡。溶脹過(guò)程中注意不要過(guò)分?jǐn)嚢?，以防顆粒破碎。待溶脹平衡后用傾瀉法除去不易沉下的細(xì)小顆粒，最后凝膠經(jīng)減壓抽氣除去氣泡，即可準(zhǔn)備裝柱。2．裝柱與平衡裝柱前須將凝膠上面過(guò)多的溶液傾出，將層析柱垂直裝好。關(guān)閉出口，向柱管內(nèi)加入約1/