線蟲研究相關(guān)技術(shù)

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1、線蟲研究相關(guān)技術(shù)1?線蟲的培養(yǎng)和分離（1）破開己感染南方根結(jié)線蟲的芹菜根系，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)通過(guò)貝爾曼漏斗法提取蟲體。從所得蟲體屮挑取卵囊，卵囊用0.2%次氯酸鈉溶液消毒0.5min后,經(jīng)無(wú)菌水沖冼。置卵囊于無(wú)菌水屮孵化，取2d后孵出的線蟲（2齡線蟲，簡(jiǎn)稱J2）供測(cè)定用。（劉晟，等，2009）（2）根結(jié)線蟲：挑取人工接種南方根結(jié)線蟲的番茄根，用組織搗碎機(jī)打碎，依次過(guò)200、325、500目線蟲標(biāo)準(zhǔn)篩，用無(wú)菌水沖洗500目篩上的蟲卵置于無(wú)菌水中孵化，取第2d孵化出的活幼蟲（2齡幼蟲，簡(jiǎn)稱J2）供測(cè)試。（趙衛(wèi)星,等，2006）o（3）線蟲的擴(kuò)大培養(yǎng)：將采集到的受馬

2、鈴薯嚴(yán)重危害的馬鈴薯薯塊用自來(lái)水沖洗干凈，剖開病薯，用刀切成薄片，然后用銀子將病薯撕成小塊，待用。在漏斗底部鋪上兩層餐巾紙，將切好的病薯小塊放入漏斗中加入無(wú)菌水，下面用帶止水夾的橡膠管相連，每隔12h左右打開止水夾用燒杯接取橡膠管中下部的液體備用o將分離到的線蟲用無(wú)菌水洗出，沖入無(wú)菌的指型管中，用0.5%的次氯酸鈉消毒2min,然后用無(wú)菌水沖洗2?3遍，使線蟲自然沉降或用離心機(jī)使線蟲快速沉淀（6000/rpm,3min）。再在離心管屮加入各約SOOmg/kg的鏈霉素（100萬(wàn)單位/g）,保持lh,離心后吸出消毒液。再用無(wú)菌水沖洗3遍，定容到一定體積后放在

3、4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｔ赑DA（約20ml）平板培養(yǎng)基上接入灰葡萄砲菌cinereaPers）,25°C溫箱中暗培養(yǎng)。待菌絲長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿后，在培養(yǎng)基中央刻一小口，加入消毒過(guò)的馬鈴薯莖線蟲約500條，將培養(yǎng)皿用封口膜（Parafilm）包好并正置放入25°C溫箱中黑暗培養(yǎng)。接種培養(yǎng)2?3d后將培養(yǎng)皿皿蓋朝下放置，繼續(xù)培養(yǎng)35?40d左右，然后將培養(yǎng)皿皿蓋上的線蟲用無(wú)菌水沖洗到燒杯中備用（閆磊,2007）o（4）線蟲的擴(kuò)大培養(yǎng)：參照劉維志（2000）描述的方法，略作改進(jìn)。釆用根結(jié)線蟲的適宜寄主番茄（品種為毛粉802）進(jìn)行繁殖，貝體方法為：采用常規(guī)方法育苗，

4、當(dāng)待接種的番茄苗長(zhǎng)出3?4片真葉時(shí)，將其移入裝有高溫滅菌砂壤土（粗砂:±=1：1）的花盆中，每盆2株；摘取南方根結(jié)線蟲卵囊或制各南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲（J2）懸浮液接種，每盆接種100個(gè)卯囊或5000個(gè)卵或幼蟲:接種后花盆擺放在日光溫室工作臺(tái)上，根據(jù)情況，每2?3天澆水一次，每隔10天施植物全營(yíng)養(yǎng)液一次；培養(yǎng)40?60天，扣盆取根系摘卵囊或取土分離根結(jié)線蟲，供試。卵的分離及卵懸浮液的制：各參照劉維志（2000）的方法，將帶有大量根結(jié)和卵囊的病根小心沖洗干凈，剪成lcm長(zhǎng)根段，并與適量水一起放入組織搗碎機(jī)中,攪拌20?30s,將攪拌器中根碎片同溶液一并倒入孔

5、徑為75um（200目）、26pm（500口）組篩內(nèi)，用自來(lái)水沖洗75urn網(wǎng)篩上的根碎片，以便盡可能在孔徑26urn網(wǎng)篩上冋收線蟲卵，將孔徑26urn網(wǎng)篩內(nèi)的線蟲卵收集于燒杯屮,定容，并在休式顯微鏡（帯有底光源）下計(jì)數(shù)。2?殺線蟲活性測(cè)是（1）測(cè)定各萃取物對(duì)南方根結(jié)線蟲的殺蟲活性。方法如下：將各組分減壓濃縮后用少量丙酮（低于1%）溶解，滴加少量吐溫?80（低于0.1%）乳化，加蒸憾水配制成lOOpg/mg的約液，取ImL用J2懸浮液（100頭線蟲/mL）稀釋2.5倍，置于（28±l）r的培養(yǎng)箱內(nèi)，分別于24、48h后觀察皿的存活情況，統(tǒng)計(jì)線蟲的存活數(shù)、

6、死亡數(shù)，計(jì)算校正死亡率。以清水為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)，線蟲死亡記數(shù)標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)，即線蟲僵直不動(dòng)的為死蟲，呈彎曲蠕動(dòng)狀態(tài)為活蟲。殺線蟲活性的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)按Chandravadana等的方法進(jìn)行。（趙衛(wèi)星等,2006）o（處理線蟲死亡率-對(duì)照線蟲死亡率）線蟲校正死亡率（％）=x100（1-對(duì)照死亡線蟲率）（2）液浸漬法：各供試提取物以蒸徭水（含（p<2%的丙酮）配制成試驗(yàn)設(shè)置濃度的溶液，取1.5mL溶液加入24孔細(xì)胞板內(nèi)，然后用膠頭滴管加入供試松材線蟲50?100條，每孔作為1次重復(fù)，每處理4次重復(fù)，對(duì)照為蒸儲(chǔ)水（含林2%的丙酮），置25°C培養(yǎng)箱處理24、4

7、8和72h后，在光學(xué)顯微鏡（4x）下檢查線蟲死亡數(shù).以蟲體發(fā)直、撥針撥動(dòng)不活動(dòng)的蟲體放人清水24h后仍不能恢復(fù)活動(dòng)的確定為死亡狀態(tài)，按下式計(jì)算校正死廣率。（馬伏寧等，2009）（處理組死亡率-對(duì)照組死亡率）校正死亡率=x100%（1-對(duì)照組死亡率）（3）室內(nèi)毒殺活性測(cè)定（藥液浸泡法）:試驗(yàn)在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)進(jìn)行，先將同樣體積（VJ定容好的線蟲懸浮液注入樣品孔內(nèi)，再根據(jù)試驗(yàn)濃度按式（3）計(jì)算需要補(bǔ)充添加的無(wú)菌水（V2）,最后加入相應(yīng)量的藥劑母液（V3）,混合均勻，置于25°C培養(yǎng)箱中，每處理4個(gè)重復(fù)，每重復(fù)50?100條線蟲。處理后24h,48h,72h

8、分別檢查各處理的線蟲死亡與存活情況，按下列公式分別計(jì)算線蟲死亡率和線蟲的校正死亡