凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物檢測方法建立及初步應(yīng)用

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1、上海第二醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物檢測方法建立及初步應(yīng)用姓名：陳紅兵申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：臨床檢驗診斷學(xué)（免疫學(xué)測定）指導(dǎo)教師：羅偉2002.5.1凝血酶一抗凝血酶復(fù)合物檢測方法的建立及其初步臨床應(yīng)用中文摘要凝血酶一抗凝血酶復(fù)合物(thrombin—antithrombincomplex，TAT)是體內(nèi)凝血酶原激活成凝血酶(thrombin，Z)后，迅速被抗凝血酶(antithrombin，AT)結(jié)合，生成共價鍵相連的無活性不可逆復(fù)合物TAT，由此維持凝血一抗凝血之間的生理平衡，目前認(rèn)為該復(fù)合物的形成是凝血酶生成的直接證據(jù)，標(biāo)志凝血系統(tǒng)的激活。檢測TAT的血漿水平可以監(jiān)測

2、凝血系統(tǒng)的激活情況，是研究生理病理狀態(tài)下凝血系統(tǒng)行為的一項有用指標(biāo)。一一、{TAT在形成過程中，凝血酶裂解抗凝血酶的Ar9393-Ser394位肽鍵，并以凝血酶絲氨酸活性中心Ser205結(jié)合抗凝血酶的Ar9393位，兩者構(gòu)象均發(fā)生一定的改變，呈現(xiàn)出一定的新抗原表位。因此，用TAT免疫小鼠來制備單克隆抗體可以得到針對T時減少與TAT前體分子的交叉反利用肝素一SepharoseCL一6B高和特異性好的單克隆抗體，同柱從人血漿中提取凝血酶和抗凝血酶，然后兩者按一定比例體外反應(yīng)，即可得到濃度和純度均較高的TAT復(fù)合物(同時含有少量AT和多余的凝血酶)。以該反應(yīng)的混合物免疫小鼠，我們制備了一系列特異

3、和非特異針對TAT的單克隆抗體，并得到了特對AT和特異針對凝血酶的單抗。經(jīng)過抗體配對試驗，用針對TAT的凝血酶部位的Ⅺ號單抗作捕獲抗體，用針對TAT之抗凝血酶部位的Ⅲ號抗體作酶標(biāo)檢測抗體，建立了檢測TAT的雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗。該法的線性檢測范圍為0．4—63．O!LLg／L，批內(nèi)cV為3．9％一5．9％，批間cV為9．1％一13．3％，回收率為92．6％一104．9％。加入20“g／ml的AT和凝血酶原對TAT檢測無影響。檢測50例含高、中、低值的血漿標(biāo)本，與用美國DADE公司的試劑盒檢測的結(jié)果比較，兩者相關(guān)系數(shù)為0．969，具有非常顯著的意義(P

4、初步臨床應(yīng)用表明，健康年輕女性較健康年輕男性TAT顯著增高，孕婦及子宮肌瘤患者TAT顯著升高。心肌梗死患者尤其是陳舊性心肌梗死患者TAT上升顯著，且與PAP(plasmin—antiplasmincomplex，纖溶酶一抗纖溶酶復(fù)合物)、DD(D-dimer，D一二聚體)、FDP(fibrin(fibrinogen)degradationproducts，纖維蛋白(原)降產(chǎn)物]顯著相關(guān)。肝病、消化道惡性腫瘤、急性白血病患者TAT也顯著升高。TAT在預(yù)測心肌梗死、監(jiān)視妊娠、肝炎等高凝狀態(tài)具有很大意義。以上結(jié)果表明，該法可用于檢測血漿TAT。為評估生理、病理狀態(tài)下的凝血系統(tǒng)行為提供了一個有用的

5、工具。1988年德國behring實驗室建立了TAT檢測方法，他們應(yīng)用兔抗人凝血酶的多抗作捕獲抗體，用兔抗人的抗凝血酶的多抗作檢測抗體。與之比較，該法則采用親和力和特異性均較強的單抗建立TAT檢測方法，填補了國內(nèi)TAT檢測能力的空白和國際上該方法學(xué)上的空白。／。關(guān)鍵詞：凝血酶禽抗凝血酶復(fù)合物層折單克隆抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗臨床應(yīng)用。、Developmentand鼬dimentalApplicationofanFnz，me-linkedImmosorbentAssaytoDeterminetheTlm妯irr-antitbrunbinComplexinPlasmaAbstractAssoona

6、sactivatedthrombinogentransformstothrombininblood,antithrombinrapidlybindstothrombinbyacovalentbondtoforminactivethrombin-antithrombincomplex，inordertomaintainthebalancebetweenthecoagulationandanti-coagulationsysten_L1hecomplexisadirectindicatorofinvivothrombingeneration．Itisagoodmolecularmarkerto

7、monitorthecoagulationsysteminImthologicalsituations．InTATformation，蚴5ofthrombinbondstoAr9393ofantithrcmbinatthesametimethatcleavageofapartoftheantithrombinpeptideandmodificationofthrombin’Sandantithrombin’Sstruct