《轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)》PPT課件

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1、1請(qǐng)輸入課題講師：轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)莫小貝2014-4-11第一講第二講第三講........目錄RNA-Seq技術(shù)背景RNA-Seq技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域RNA-Seq技術(shù)原理RNA-Seq技術(shù)優(yōu)勢(shì)RNA-Seq技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)及發(fā)展2014-4-12第一節(jié)RNA-Seq技術(shù)背景RNA-Seq又稱轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序（transcriptomesequencing）或稱為全轉(zhuǎn)錄組鳥槍法測(cè)序（WholeTranscriptomShotgunSequencingWTSS）2014-4-13RNA-Seq技術(shù)背景2014-4-1原則上，所有的

2、高通量測(cè)序技術(shù)都能進(jìn)行RNA測(cè)序，自2005年以來(lái)，Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)為標(biāo)志的新一代測(cè)序技術(shù)相繼誕生，之后HelicosBiosicences公司有推出單分子測(cè)序（Singlemoleculesequencing,SMS）技術(shù)。新一代測(cè)序技術(shù)又稱作深度測(cè)序或高通量測(cè)序，是相對(duì)于傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序而言，主要特點(diǎn)是測(cè)序高通量，測(cè)序時(shí)間和成本顯著下降。各平臺(tái)測(cè)序原理及序列長(zhǎng)度的差異決定了各種高通量測(cè)序儀具有不同的應(yīng)用側(cè)重。羅氏公司魯米那公司高通量

3、測(cè)序法原理美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司寡聚物連接檢測(cè)測(cè)序赫利公司4RNA-Seq技術(shù)背景2014-4-1廣義：指某一生理?xiàng)l件下，細(xì)胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合，包括信使RNA、核糖體RNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA及非編碼RNA。轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）狹義：指所有mRNA的集合。52014-4-1RNA-Seq技術(shù)背景轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)：是指利用第二代高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行cDNA測(cè)序，全面快速地獲取某一物種特定器官或組織在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本。62014-4-1RNA-Seq技術(shù)背景高通量測(cè)序技術(shù)（High-throughputse

4、quencing）是指能夠一次并行對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)序，每一次序列測(cè)定的讀長(zhǎng)一般較短的測(cè)序技術(shù)。高通量測(cè)序技術(shù)是對(duì)傳統(tǒng)測(cè)序一次革命性的改變，一次對(duì)幾十萬(wàn)幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)序，因此在有些文獻(xiàn)中稱其為下一代測(cè)序技術(shù)（nextgenerationsequencing）組件其劃時(shí)代的改變，同時(shí)高通量測(cè)序使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測(cè)序（deepsequencing）72014-4-1RNA-Seq技術(shù)背景有關(guān)于ncRNA的一些知識(shí)非編碼RNA（ncRN

5、A）主要包括：轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA），核糖體RNA(rRNA)，小核RNA（snRNA），核仁小分子RNA（snoRNA），細(xì)胞質(zhì)小分子RNA（scRNA），不均一核RNA（hnRNA）及小RNA（microRNA,miRNA）等。功能：非編碼RNA具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用，如對(duì)染色體結(jié)構(gòu)、RNA加工修飾及穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄和翻譯及一些蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響。8第二節(jié)RNA-Seq技術(shù)原理2014-4-1把高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用到有mRNA逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA上，從而獲得來(lái)自不同基因的mRNA片段在特定樣本中的含量，這就是mRNA片段

6、或mRNA-Seq，同原理，各種類型的轉(zhuǎn)錄本都可以用深度測(cè)序技術(shù)進(jìn)行高通量檢測(cè)，統(tǒng)稱作RNA-Seq。92014-4-1RNA-Seq實(shí)驗(yàn)流程圖102014-4-1RNA-Seq實(shí)驗(yàn)步驟112014-4-1RNA-Seq測(cè)序數(shù)據(jù)的分析122014-4-1RNA-Seq提供試驗(yàn)報(bào)告原始數(shù)據(jù)報(bào)告（Fasta-Q格式），包含所有測(cè)序序列信息，堿基讀取質(zhì)量評(píng)估基本數(shù)據(jù)分析報(bào)告（Excel表格），包含有效序列的序列信息、與參考基因組比對(duì)后的注釋信息等。高級(jí)數(shù)據(jù)分析（應(yīng)客戶要求定制），如基因覆蓋率和測(cè)序深度分析，基因表達(dá)差異分析，

7、基因結(jié)構(gòu)分析，鑒定選擇性剪切現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)新基因，鑒定基因融合現(xiàn)象。13第三節(jié)2014-4-1RNA-Seq技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域14第四節(jié)2014-4-1RNA-Seq技術(shù)優(yōu)勢(shì)*數(shù)字化信號(hào)：直接測(cè)定每個(gè)轉(zhuǎn)錄本片段序列，單核苷酸分辨率的精確度，同時(shí)不存在傳統(tǒng)微陣列雜交的熒光模擬信號(hào)帶來(lái)的交叉反應(yīng)和背景噪音問(wèn)題。*高靈敏度：能夠檢測(cè)到細(xì)胞中少至幾個(gè)拷貝的稀有轉(zhuǎn)錄本。*任意物種的全基因組分析：無(wú)需預(yù)先設(shè)計(jì)特異性探針，因此無(wú)需了解物種基因信息，能夠直接對(duì)任何物種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。同時(shí)能夠檢測(cè)未知基因，發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本，并精確地識(shí)別可變剪切位點(diǎn)

8、及cSNP，UTR區(qū)域。*更廣的檢測(cè)范圍：高于6個(gè)數(shù)量級(jí)的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍，能夠同時(shí)鑒定和定量稀有轉(zhuǎn)錄本和正常轉(zhuǎn)錄本。15第五節(jié)2014-4-1RNA-Seq技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)及發(fā)展RNA-Seq的發(fā)展前景雖然RNA-Seq的技術(shù)還面臨著種種困難，但作為一個(gè)剛剛起步的新技術(shù)RNA-Seq出其他轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)：既能提供單堿基分辨