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《轉(zhuǎn)錄組測序技術原理及應用.ppt》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在PPT專區(qū)-天天文庫。
1、RNA測序技術原理及應用遺傳的中心法則基因組—轉(zhuǎn)錄組—表觀遺傳組—蛋白組層次什么是轉(zhuǎn)錄組？All transcriptsAll mRNAsRNA是解讀基因組的關鍵RNAProteinPhenotypeGenotypeDNA測序技術RNA-SeqSmallRNA測序降解組測序Non-codingRNA測序研究對象mRNASmallRNAmRNANon-codingRNA鑒定新分子OOOO表達譜研究OOOO基因結(jié)構(gòu)分析O/XXXOEST測序O/XXXX篩選分子標記OOOX轉(zhuǎn)錄融合基因表達O/XXXXRNA測序技術WorkflowofRNA-Seq樣
2、品檢測文庫制備ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析TotalRNA樣品檢測Agilent2200檢測OD260/280:1.8~2.2RNA28S:18S≥1.0;RIN≥7新型安捷倫2200TapeStation系統(tǒng)是新一代測序（NGS）、生物微陣列芯片分析和qPCR工作流程以及蛋白質(zhì)純化和抗體生產(chǎn)過程中對生物樣品進行質(zhì)量控制（QC）的理想解決方案?！窨蓴U展的通量—16聯(lián)或96孔微量滴定板●快速得到結(jié)果—平均每個樣品只需一分鐘便可獲得結(jié)果●使用簡單—可直接使用的ScreenTape預制膠條簡化了工作流程
3、●樣品用量少—每次運行僅需要不到2ul樣品檢測報告-合格樣品棉鈴蟲/果蠅檢測報告-不合格樣品WorkflowofRNA-Seq樣品檢測文庫制備ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析真核mRNA的純化mRNA的純化主要通過的磁珠與生物素吸附原理從而分離純化Oligo（dT）25磁珠純化原理主要是mRNA的3′的polyA與磁珠在bindingbuffer的作用下相結(jié)合。磁珠通過MPC（磁分離器）從溶液中分離出來。mRNA與磁珠結(jié)合后，再用Tris-HCL在加熱條件下解離洗脫到溶液中。鏈霉親合素包被磁珠+生物素
4、標記Oligo（dT）25+poly（A）原核mRNA的純化AmbionMICROExpressKitLNA扣鎖型探針mRNA反轉(zhuǎn)錄---fragment+RT純化過的mRNA樣品加入1μl的fragmentbuffer70℃作用1.5min。加入1μl的stopbuffer終止反應。加入沉淀劑（NaAc糖原無水乙醇）沉淀產(chǎn)物。RTdscDNA末端修復(防止自連）cDNA3′末端加AAdapter連接第一天消化DNAmRNA的分離mRNA的打斷cDNA的合成↓↓第二天末端修復↓↓加接頭膠回收3’端加A第三天PCRPCR膠回收↓↓文庫制備↓↓文庫
5、質(zhì)量檢測：Aligent2100：片段大小、純度、濃度qPCR：片段大小、濃度手工檢測：跑膠驗證。WorkflowofRNA-Seq樣品檢測文庫制備ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析ApplicationRNA-Seq(單端測序---Quantification)RNA-Seq(雙端測序---Transcriptome)Expression-profiling√√AlternativeSplicing－√FusionGene－√SNPdetection－√HiSeq2500ApplicationsofR
6、NA-Seq17RNA-Seq(Transcriptome)WorkflowofRNA-Seq(Transcriptome)生物信息學分析RNA-Seq(Transcriptome)CharacterizethetranscriptomeinunparalleleddetailTechnique220RNA-Seq(Denovotranscriptomeassembly)RNA-Seq(Transcriptomeresequencing)RNA-Seq(Denovotranscriptomeassembly)文庫構(gòu)建測序組裝Denovoasse
7、mbleatranscriptome組裝流程數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計及測序數(shù)據(jù)的成分和質(zhì)量評估組裝結(jié)果分析（Contig長度分布、Scaffold長度分布、Unigene長度分布）Unigene（transcript）功能注釋Unigene的GO分類Unigene代謝通路分析預測編碼蛋白框（CDS）Unigene表達差異分析（兩個或兩個以上樣品）Unigene在樣品間的差異GO分類（需兩個或兩個以上樣品）和Pathway富集性分析Denovoassemblytranscriptome信息分析主要內(nèi)容：Denovoassemblytranscriptome信
8、息分析流程Unigenes的GO注釋Pathway分析RNA-Seq(Transcriptomeresequencing)cDNA文庫構(gòu)建測序比對到參
