聚羥基脂肪酸酯高產(chǎn)菌株篩選

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1、聚卷基脂肪酸酯高產(chǎn)菌株篩選摘要：目的：探討聚輕基脂肪酸酯產(chǎn)生菌的篩選方法。方法：從土壤中取樣，經(jīng)過尼羅藍熒光初篩、蘇丹黑染色復篩，篩選菌株。結果：成功地獲得聚釋基脂肪酸酯生產(chǎn)菌并將其命名為Rhizobiumsp.H2-5,其胞內(nèi)產(chǎn)物產(chǎn)率為36.96%O結論：通過尼羅藍熒光初篩、蘇丹黑染色復篩進行聚軽基脂肪酸酯高產(chǎn)菌株篩選，方法準確、可靠，值得應用推廣。關鍵詞：聚釋基脂肪酸酯；尼羅藍；篩選1材料與方法1.1材料及試劑Ls-C50L立式壓力蒸汽滅菌器(江陰濱江醫(yī)療設備廠)；HZQ-Q全溫振蕩搖床(中國哈爾濱東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司)；Fr

2、iocell生化培養(yǎng)箱(BMHIndustrumentsCo.);AnkeTGL-16G高速離心機(上海安亭科學儀器廠)；S-3700N掃描電子顯微鏡(日本日立公司)；1%的尼羅藍溶液；0.3%(w/v)的蘇丹黑B染液、0.5%(w/v)的番紅染液等。富集培養(yǎng)基(g/L)[lJ：醋酸鈉10.0,酵母粉1.5,Na2HP04?12H203.8,KH2PO42.65,MgS04?7H200.2,CaC120.05,FeC130.01,ZnS040.01；篩選培養(yǎng)基：含瓊脂2%,尼羅藍濃度為50ug/mL的富集培養(yǎng)基。1.2方法1.2.1初

3、篩[2]取溶于水的土壤樣品上層液1.OmL,接于10.OmL富集培養(yǎng)液中32"富集培養(yǎng)24h,反復傳代培養(yǎng)至獲得純培養(yǎng)菌株。取富集培養(yǎng)液對滅菌后篩選培養(yǎng)基進行梯度稀釋，然后涂布到初篩培養(yǎng)基上。初篩培養(yǎng)基321恒溫條件下倒置培養(yǎng)48h,在波長365nm紫外燈下觀察，標記并挑取發(fā)熒光的單菌落保存。1.2.2復篩純培養(yǎng)菌株搖床培養(yǎng)48h后，離心分離棄上清液，挑取離心后得到的菌體涂片、干燥、固定，蘇丹黑B染液染色15min,洗脫至無色，再用番紅染液復染2min,水洗，鏡檢觀察是否有藍黑色的脂肪顆粒[3]。1.2.3PHA提取取復篩后的菌株搖床

4、培養(yǎng)，收集、離心發(fā)酵液，收集菌體并烘干至恒重，稱量得干菌體重量(CDW/g)o加入氯仿超聲提取，向提取液中加入50ml甲醇水溶液析出白色絮狀固體PHA[4],抽濾分離出PHA,再次烘干至恒重，稱量得PHA提取量。1.2.4鑒定制涂片進行革蘭氏染色以及芽胞染色，顯微鏡下觀察菌體大小、形態(tài)以及有無芽鞄生成。2結果2.1初篩菌落呈現(xiàn)黃綠色，黃色和橙色熒光色。根據(jù)熒光色的差異分得11株純培養(yǎng)物，接種至斜面培養(yǎng)基上，『C低溫保存。2.2復篩菌體外圍泛紅，菌體內(nèi)部可見明顯的藍黑色顆粒的菌株可能是產(chǎn)生PHA的細菌。2.3胞內(nèi)產(chǎn)物提取率根據(jù)PHA提取

5、率（％）=Wp：Wc=（PHA提取量/CDW）X100%[5]計算各產(chǎn)物的提取率。菌株H2-5的胞內(nèi)產(chǎn)物產(chǎn)率最高，達到36.96%O其次為H2-2,提取率為27.32%,具體結果見表lo2.4鑒定結果菌株H2-5的菌落呈圓形，表面光滑，大小均一，邊緣整齊，菌落潮濕呈淡黃色，半透明。革蘭氏染色結果表明菌株H2-5為革蘭氏陰性菌，菌體形狀為桿狀，無莢膜，不形成芽胞。3結束語聚務基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoate,PHA）是可以由很多細菌合成的一種細胞內(nèi)聚酯，在生物體內(nèi)主要作為細胞內(nèi)碳源貯藏性物質(zhì)而存在，因而具有廣泛應用的

6、價值[6]。本研究采用尼羅藍熒光初篩、蘇丹黑染色復篩進行聚軽基脂肪酸酯高產(chǎn)菌株篩選，擴大了菌株資源，并獲得一株新菌株，為進一步開發(fā)PHA的應用奠定基礎。此外，我們還對菌株H2-5進行了生理生化實驗、并繪制生長曲線。結果與文獻[7]所述一致，均表明菌株H2-5不能水解利用淀粉作為碳源，也不能利用檸檬酸鹽，且適應期短，生長快速，接種18h左右就可達到穩(wěn)定狀態(tài)。對提取菌株H2-5基因組DNA進行16SrDNA基因擴增測序，結果表明H2-5為根瘤菌屬。參考文獻[1]張圓，孫雪南，陳邦，等?利用微生物混合培養(yǎng)技術生產(chǎn)聚軽基烷酸(PHA)研究[J

7、].微生物學報,2003,43(006)：799-804.[2]YilmazM,SoranH,BeyatliY.Determinationofpoly-B-hydroxybutyrate(PHB)productionbysomeBacillusspp.WorldJournalofM-icrobiology&Biotechnology,2005,21：565~56.[3]GanduriV,GhoshS,PatnaikP.MixingcontrolasadevicetoincreasePHBproductioninbatchferment

8、ationswithcoculturesofLactobacillusdelbrueckiiandRaistoniaeutropha[J].ProcessBiochemistry,2005,40：257-264.[4]堵