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1、熒光定量檢測HBV?DNA臨床研究【中圖分類號】R450【文獻標識碼】A【文章編號】1005-2720(2010)01-025-01【摘要】目的了解乙肝患者HBVDNA含量及HBVDNA陽性患者用藥前后的療效觀察。方法應(yīng)用熒光PCR擴增病毒核酸免疫技術(shù)定量檢測6018例血清標本的HBVDNA含量。結(jié)果熒光定量PCR的特點與定性PCR主要區(qū)別在于熒光PCR即時反映擴增過程，采用內(nèi)標法全封閉減少污染,高靈敏的自動化儀器對熒光的收集和分析能達到對原始模板量定量檢測。結(jié)論用此方法可較準確及時地為臨床提供科學(xué)的診斷依據(jù)，并對HBVDNA陽性病人用藥前后提供可靠數(shù)據(jù)。血清HBV標志物的檢
2、測給臨床診斷乙肝病毒感染提供了較為便捷的診斷依據(jù)，在臨床應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)由于病情的發(fā)展過程的結(jié)局的多樣性,尤其是肝功轉(zhuǎn)氨酶正常而體內(nèi)確實有病毒復(fù)制者的治療中，定量PCR檢測HBV-DNA為HBV感染及其療效的判定提供了一項重要指標，我院引進熒光定量PCR檢測技術(shù)，共檢測乙肝病毒感染者及疑是感染者的HBV-DNA含量6018例，現(xiàn)總結(jié)分析，報告如下。1材料與方法1.1材料1.1.1儀器Bio-RadiCycler多熒光頻道可用于乙肝病毒DNA檢測。1.1.2試劑盒由深圳匹基公司引進美國技術(shù)研制生產(chǎn)。1.1.3資料收集我院2008年3月至2009年5月門診及住院患者的血清，取清晨空
3、腹靜脈血3mL送檢。1.2方法1.2.1原理PCR是聚合酶鏈式反應(yīng)，是一種體外內(nèi)引物介導(dǎo)的特定DNA序列的酶促合成反應(yīng),1985年由美國Cotus公司Mullis等提出。1.2.2熒光定量PCR特點與定性PCR的主要區(qū)別:定量PCR采用終點定量(endpointPCR),在PCR循環(huán)結(jié)束后對PCR擴增產(chǎn)物進行檢測定量化，最大范圍為4個數(shù)量級;對數(shù)期定量(logphasePCR)是在PCR的對數(shù)增長期對PCR擴增產(chǎn)物進行檢測定量化,最大定量范圍可達到10個數(shù)量級;熒光PCR利用熒光染料在光刺激下釋放的熒光能量的變化又直接反映出擴增產(chǎn)物量的變化，熒光信號變量與擴增產(chǎn)物變量成正比。
4、并通過足夠靈敏的自動化儀器，實現(xiàn)對熒光的采集和分析以達到對原始模板定量檢測的目的。我院就是應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)開展對乙肝病人及疑是HBV-DNA感染者進行檢測。1.3統(tǒng)計學(xué)處理計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)士標準差(x土s)表示，多組間比較采用F檢驗,兩兩比較采用q檢驗。計數(shù)資料比較采用X2檢驗。以P<0.05為有顯著性差異。2結(jié)果我院共檢測住院及門診病人血清6018人次，統(tǒng)計分析結(jié)果見表1O注:A:HBsAg(+),HBeAg(+),HBcAb(+)C:HBsAg(+),HBcAb(+)B:HBsAg(+),HBeAb(+),HBcAb(+)3討論根據(jù)資料報道，我國有1.6億慢性HB
5、sAg攜帶者口］,合理而適當?shù)奶幚磉@些人群的問題不僅是醫(yī)學(xué)問題而且是重要的社會問題。我國的感染率約為10%,而受HBV慢性感染的人群患原發(fā)性肝癌的相對危險性至少增加300倍。對HBV感染的防治仍是我國健康與傳染病控制中的首要問題。其中一部分患者有可能發(fā)展為肝硬化甚至肝癌。處于亞健康狀態(tài)的人得到合適的處理。當肝功能正常，但HBV-DNA陽性,B超無異常的可早期治療，需每年追蹤觀察,個體治療療效觀察做HBVDNA定量顯得尤其重要［2］。定期觀察HBV量的變化，可作為抗病毒藥物療效觀察指標，可直接反映病原體滴度是否受藥物影響發(fā)生變化，了解病毒在體內(nèi)的復(fù)制及傳染性，并對臨床HBV感染
6、的診斷、治療方案的選擇及療效判定有很好的指導(dǎo)作用［3］。用免疫熒光核酸定量分析，因其方法有極高的靈敏性和特異性[4],能準確測定岀HBV-DNA拷貝值（1個拷貝鏈約為150對堿基）。根據(jù)HBVDNA含量的高低,加上肝功能可判斷其是否有病毒復(fù)制，是否需抗病毒治療，特別對早期發(fā)現(xiàn)HBV感染的窗口期治療更有意義。HBV-DNA定量檢測能準確反映病毒復(fù)制情況，是HBV治療唯一有效的直接療效監(jiān)測指標⑸,是動態(tài)觀察藥物療效的確切指標。只有掌握患者體內(nèi)HBV復(fù)制情況,才能做出正確的臨床診斷和選擇更合理的治療方案來進行治療。本試驗應(yīng)用熒光PCR內(nèi)標法，采用兩個不同波長的熒光探針，分別與病原體
7、模板DNA及內(nèi)標結(jié)合，并在PCR過程中釋放兩個不同波長的熒光信號,通過兩個熒光信號的關(guān)系反映出真實病原體DNA含量。全封閉反應(yīng)減少污染，無需PCR后處理，特異性強，靈敏度高;采用對數(shù)期分析摒棄終點數(shù)據(jù),定量準確。操作時間短,其敏感性也高于斑點雜交?！緟⒖嘉墨I】[1]計一平，等?病毒性肝炎免疫治療進展?臨床肝膽病雜志,2001,17(1):7-8.[2]AbeA,InoueK,TanakaT,etal.QuantitationofhepatitisBvirusgenomicDNAbyreal-timePC
