病理基因測(cè)序技術(shù)及臨床應(yīng)用

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1、病理基因測(cè)序技術(shù)及臨床應(yīng)用【摘要】目的：應(yīng)用基因測(cè)序儀對(duì)腫瘤及相關(guān)疾病進(jìn)行臨床病理基因直接測(cè)序，以指導(dǎo)醫(yī)療保健、疾病預(yù)防、基因治療。方法：石蠟組織、血液標(biāo)本提取DNA,經(jīng)凝膠成像及核酸定量?jī)x定量、定性，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物及購(gòu)買測(cè)序試劑盒，經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行基因測(cè)序，通過(guò)SeqScap軟件診斷分析測(cè)序結(jié)果，并對(duì)陽(yáng)性結(jié)果做反向測(cè)序證實(shí)。結(jié)果：石蠟組織標(biāo)本DNA提取成功率80%，總提取成功率90%以上，在此基礎(chǔ)上的PCR擴(kuò)增、純化及測(cè)序成功率達(dá)99%。測(cè)序基線平整，平均信號(hào)強(qiáng)度在200~1000之間，噪音<5,

2、Raw基線接近0。預(yù)報(bào)分子靶向藥物治療有效率及無(wú)效率均達(dá)100%。結(jié)論：臨床病理基因測(cè)序是癌癥基因組計(jì)劃的核心內(nèi)容，基因測(cè)序技術(shù)可以快速準(zhǔn)確地完成腫瘤基因序列分析，該技術(shù)重復(fù)率高、結(jié)果可靠、科學(xué)性強(qiáng)，是分子病理學(xué)發(fā)展的一個(gè)重要新領(lǐng)域。【關(guān)鍵詞】基因測(cè)序；癌癥基因組；SeqScap軟件隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，基因診斷已受到廣泛關(guān)注。我院2004年引進(jìn)美國(guó)ABI3100Avant遺傳分析儀及SeqScap測(cè)序診斷軟件，根據(jù)GeneBank基因序列選擇WHOPathology&Genetics列出的與疾病有

3、重要意義的基因及其片段，使用測(cè)序儀測(cè)定靶基因的核昔酸序列，應(yīng)用SeqScap軟件自動(dòng)診斷臨床病理標(biāo)本。目前對(duì)腫瘤、癌前病變和心腦血管等多種疾病全面開(kāi)展P53全基因組、Kras基因、BRCA1全基因組、Ckit基因、EGFR基因、APC基因、YMDD乙肝病毒耐藥基因和APOE基因多態(tài)性序列分析，并開(kāi)始嘗試與美國(guó)癌癥基因組(TCGA)計(jì)劃接軌。1材料與方法1.1材料所有材料均為臨床快速冰凍送檢組織、甲醛固定組織和心腦血管疾病及健康體檢人群血液標(biāo)本計(jì)890例，對(duì)照組織為非腫瘤切端或血液標(biāo)本210例。1.2主要儀器

4、與試劑美國(guó)ABI3100AvantGeneticAnalyzer遺傳分析儀、ABIGeneAmpPCRSystem2700、Promega公司A1120基因組DNA提取試劑盒、Qiagen公司HotStarTaqDNAPolymerase及ABIBigDyeTerminatorv3.1Kit測(cè)序試劑盒(Part.No4336917)。1.3方法1.3.1引物設(shè)計(jì)根據(jù)NCBI和WHO相關(guān)文獻(xiàn)選擇臨床意義明確的候選目的基因，使用Oligo軟件設(shè)計(jì)引物，由上海生物工程公司合成。其中,APOE基因引物特異性擴(kuò)增其第

5、4外顯子區(qū)含編碼112位與158位氨基酸序列，產(chǎn)物片段358bp。Kras基因引物擴(kuò)增其第1外顯子區(qū)，產(chǎn)物片段397bp。EGFR基因第18、19、21外顯子，產(chǎn)物片段分別為437、411、399bpoCkit基因第11外顯子的產(chǎn)物片段378bp、乙肝耐藥基因(YMDD)產(chǎn)物片段338bp等。1.3.2基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增條件的建立取受檢對(duì)象靜脈血2ml,肝素抗凝處理，按說(shuō)明書提取DNA,-18°C保存?zhèn)溆谩?0n1PCR反應(yīng)體系：10PCRBuffer(含15mMMgC12)2p1,HotStar

6、TaqDNAPolymerase0.2jli1,5QSolution4y1,dNTPmix(10mMofeach)2uh上下游引物各1nL模板DNA11,Distilledwater8.8pLPCR反應(yīng)條件：95°C預(yù)變性15min,用TouchdownPCR技術(shù)，94°C變性50sec,63OC_58°C退火1min(-0.5°C/min),72°C延伸1min,共循環(huán)10次；94°C變性50s,57°C退火1min,72°C延伸1min,循環(huán)30次，最后72°C延伸10mine1.3.3PCR產(chǎn)物純化及

7、測(cè)序用1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是否為單一目的條帶，用Vgene公司PCR產(chǎn)物純化試劑盒，過(guò)柱純化后進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。10m1測(cè)序反應(yīng)體系：1M1BigDye+1.5p1BigDyeSequencingBuffer+3yl上游引物+1卩1PCR純化產(chǎn)物+3.5u1ddH20o測(cè)序PCR熱循環(huán)條件：96°C,10sT(96°C10s-50°C5s-60°C4min)x25個(gè)循環(huán)-60°C,4min-4°C保溫。測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物純化后(酒精/NaAc法),經(jīng)95°C變性4min,迅速置冰水中冷卻4min,

8、上樣至ABI3100Avant遺傳分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，在Datecollection2.0軟件下運(yùn)行并獲取結(jié)果。1.3.4SeqScap軟件自動(dòng)診斷分析將測(cè)序結(jié)果用DNAsequencinganalysis5.1軟件自動(dòng)分析原始測(cè)序數(shù)據(jù)，獲取測(cè)序電泳圖和序列圖，然后進(jìn)入SeqScap軟件自動(dòng)診斷程序。圖1APOE基因E4/3基因型（略）圖2P53基因C/T雜合突變（略）圖3EGFR基因（略）2結(jié)果與討論石蠟組織