基因測(cè)序技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用

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1、基因測(cè)序技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用ok3ina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)為標(biāo)志的新一代測(cè)序(next-generationsequencing,NGS)的相繼出現(xiàn),測(cè)序效率明顯提升,時(shí)間明顯縮短,費(fèi)用明顯降低,基因檢測(cè)手段有了革命性的變化。其技術(shù)正向著大規(guī)模、工業(yè)化的方向發(fā)展,極大地提高了基因檢測(cè)的檢出率,并擴(kuò)展了疾病在基因水平的研究范圍。2009年3月,約翰霍普金斯大學(xué)的研究人員在《Science》雜志上發(fā)表了通過(guò)NGS外顯子測(cè)序技術(shù),發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的遺傳性胰腺癌的致病基因PALB2,標(biāo)志著

2、NGS測(cè)序技術(shù)成功應(yīng)用于致病基因的鑒定研究。同年,《Nature》發(fā)表了采用NGS技術(shù)發(fā)現(xiàn)罕見弗里曼謝爾登綜合征MYH3致病基因突變和《NatGe》發(fā)表了遺傳疾病米勒綜合征致病基因。此后,通過(guò)NGS技術(shù),與遺傳相關(guān)的致病基因不斷被發(fā)現(xiàn),NGS技術(shù)已成為里程碑式的進(jìn)步。2010年,《Science》雜志將這一技術(shù)評(píng)選為當(dāng)年“十大科學(xué)進(jìn)展”。近兩年,基因檢測(cè)成為臨床診斷和科學(xué)研究的熱點(diǎn),得到了突飛猛進(jìn)和日新月異的發(fā)展,越來(lái)越多的臨床和科研成果不斷涌現(xiàn)出來(lái)。同時(shí),基因檢測(cè)已經(jīng)從單一的遺傳疾病專業(yè)范疇擴(kuò)展到復(fù)雜疾病

3、和個(gè)體化應(yīng)用更加廣闊的領(lǐng)域,其臨床檢測(cè)范圍包括高危疾病的新生兒篩查、遺傳疾病的診斷和基因攜帶的檢測(cè)以及基因藥物檢測(cè)用于指導(dǎo)個(gè)體化用藥劑量、選擇和藥物反應(yīng)等諸多方面的研究。目前,基因檢測(cè)在臨床診斷和醫(yī)學(xué)研究的應(yīng)用正越來(lái)越受到醫(yī)生的普遍重視和引起研究人員的極大的興趣。本文介紹了幾種DNA水平基因檢測(cè)常見的方法,比較其優(yōu)缺點(diǎn)和在臨床診斷和科學(xué)研究中的應(yīng)用,對(duì)指導(dǎo)研究生和臨床醫(yī)生課外學(xué)習(xí),推進(jìn)臨床科研工作和提升科研教學(xué)水平有著指導(dǎo)意義。1、第一代測(cè)序1.1Sanger測(cè)序采用的是直接測(cè)序法。1977年,Freder

4、ickSanger等發(fā)明了雙脫氧鏈末端終止法,這一技術(shù)隨后成為最為常用的基因測(cè)序技術(shù)。2001年,AllanMaxam和orton等提出優(yōu)勢(shì)對(duì)數(shù)記分法(logoddsscoremethod,LOD),主要檢測(cè)兩基因以某一重組率連鎖時(shí)的似然性。LOD值為正,支持連鎖;LOD值為負(fù),則否定連鎖。通過(guò)計(jì)算家系中的微衛(wèi)星標(biāo)記與致病位點(diǎn)之間的LOD值,可以初步估算二者間的遺傳距離及連鎖程度,從而確定該基因在染色體上的粗略位置。然后利用該區(qū)域的染色體基因圖譜,分析定位區(qū)域內(nèi)所有基因的功能與表達(dá),選擇合適的候選基因進(jìn)行突

5、變檢測(cè),最終將致病基因定位或克隆。然而,采用連鎖分析進(jìn)行基因檢測(cè)存在很大的局限性。不但所需遺傳樣本量較大,一般要求提供三代及以上遺傳家系患者血樣,而且數(shù)據(jù)量大、處理復(fù)雜、產(chǎn)出速度較慢、定位不夠精確(一般只能定位在染色體某一區(qū)間),這就使得研究工作繁重和定位基因的時(shí)間周期特別長(zhǎng)。目前,連鎖分析采用的單核苷酸多肽性和短串聯(lián)重復(fù)序列還在使用,但經(jīng)典的間接測(cè)序方法,如單鏈構(gòu)象多肽性、變性梯度凝膠電泳和異源雙鏈分析在美國(guó)已被淘汰,而在發(fā)展中國(guó)家作為研究手段還在有限使用。2、新一代測(cè)序(NGS)主要包括全基因組重測(cè)序(

6、esequencing,之間,不僅包括編碼區(qū)同時(shí)也加入了部分非編碼區(qū)。NGS的測(cè)序過(guò)程主要包括DNA測(cè)序文庫(kù)的制備、錨定橋接、PCR擴(kuò)增、單堿基延伸測(cè)序和數(shù)據(jù)分析。研究者根據(jù)測(cè)序儀捕獲到在測(cè)序過(guò)程中摻入有不同熒光標(biāo)記堿基片段,經(jīng)計(jì)算機(jī)將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)化成不同顏色的測(cè)序峰圖和堿基序列?；驕y(cè)序結(jié)果與NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫(kù)、千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)等國(guó)際權(quán)威數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),最終確定是否為突變基因。自NGS技術(shù)問(wèn)世以來(lái),利用WES在臨床疾病致病基因的鑒定研究中取得前所未有的成果。這些成果不僅集中在單基因遺傳疾病,還在多基因影響的

7、復(fù)雜疾病中獲得大量相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)。在單基因遺傳性疾病中,如視網(wǎng)膜色素變性、終端骨發(fā)育不良等發(fā)現(xiàn)新基因或已知基因新突變。在一些罕見的疾病中,如Kabuki綜合征、家族性混合型低脂血癥和脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)癥等疾病中發(fā)現(xiàn)新的致病基因。同時(shí),在小細(xì)胞肺癌、慢性淋巴細(xì)胞性白血病等腫瘤研究和諸如肥胖癥、腦皮質(zhì)發(fā)育不良等復(fù)雜疾病的研究中也取得豐碩成果。