基因測序技術(shù)的優(yōu)缺點及應用

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1、基因測序技術(shù)的優(yōu)缺點及應用ok3ina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)為標志的新一代測序(next-generationsequencing,NGS)的相繼出現(xiàn),測序效率明顯提升,時間明顯縮短,費用明顯降低,基因檢測手段有了革命性的變化。其技術(shù)正向著大規(guī)模、工業(yè)化的方向發(fā)展,極大地提高了基因檢測的檢出率,并擴展了疾病在基因水平的研究范圍。2009年3月,約翰霍普金斯大學的研究人員在《Science》雜志上發(fā)表了通過NGS外顯子測序技術(shù),發(fā)現(xiàn)了一個新的遺傳性胰腺癌的致病基因PALB2,標志著

2、NGS測序技術(shù)成功應用于致病基因的鑒定研究。同年,《Nature》發(fā)表了采用NGS技術(shù)發(fā)現(xiàn)罕見弗里曼謝爾登綜合征MYH3致病基因突變和《NatGe》發(fā)表了遺傳疾病米勒綜合征致病基因。此后,通過NGS技術(shù),與遺傳相關(guān)的致病基因不斷被發(fā)現(xiàn),NGS技術(shù)已成為里程碑式的進步。2010年,《Science》雜志將這一技術(shù)評選為當年“十大科學進展”。近兩年,基因檢測成為臨床診斷和科學研究的熱點,得到了突飛猛進和日新月異的發(fā)展,越來越多的臨床和科研成果不斷涌現(xiàn)出來。同時,基因檢測已經(jīng)從單一的遺傳疾病專業(yè)范疇擴展到復雜疾病

3、和個體化應用更加廣闊的領域,其臨床檢測范圍包括高危疾病的新生兒篩查、遺傳疾病的診斷和基因攜帶的檢測以及基因藥物檢測用于指導個體化用藥劑量、選擇和藥物反應等諸多方面的研究。目前,基因檢測在臨床診斷和醫(yī)學研究的應用正越來越受到醫(yī)生的普遍重視和引起研究人員的極大的興趣。本文介紹了幾種DNA水平基因檢測常見的方法,比較其優(yōu)缺點和在臨床診斷和科學研究中的應用,對指導研究生和臨床醫(yī)生課外學習,推進臨床科研工作和提升科研教學水平有著指導意義。1、第一代測序1.1Sanger測序采用的是直接測序法。1977年,Freder

4、ickSanger等發(fā)明了雙脫氧鏈末端終止法,這一技術(shù)隨后成為最為常用的基因測序技術(shù)。2001年,AllanMaxam和orton等提出優(yōu)勢對數(shù)記分法(logoddsscoremethod,LOD),主要檢測兩基因以某一重組率連鎖時的似然性。LOD值為正,支持連鎖;LOD值為負,則否定連鎖。通過計算家系中的微衛(wèi)星標記與致病位點之間的LOD值,可以初步估算二者間的遺傳距離及連鎖程度,從而確定該基因在染色體上的粗略位置。然后利用該區(qū)域的染色體基因圖譜,分析定位區(qū)域內(nèi)所有基因的功能與表達,選擇合適的候選基因進行突

5、變檢測,最終將致病基因定位或克隆。然而,采用連鎖分析進行基因檢測存在很大的局限性。不但所需遺傳樣本量較大,一般要求提供三代及以上遺傳家系患者血樣,而且數(shù)據(jù)量大、處理復雜、產(chǎn)出速度較慢、定位不夠精確(一般只能定位在染色體某一區(qū)間),這就使得研究工作繁重和定位基因的時間周期特別長。目前,連鎖分析采用的單核苷酸多肽性和短串聯(lián)重復序列還在使用,但經(jīng)典的間接測序方法,如單鏈構(gòu)象多肽性、變性梯度凝膠電泳和異源雙鏈分析在美國已被淘汰,而在發(fā)展中國家作為研究手段還在有限使用。2、新一代測序(NGS)主要包括全基因組重測序(

6、esequencing,之間,不僅包括編碼區(qū)同時也加入了部分非編碼區(qū)。NGS的測序過程主要包括DNA測序文庫的制備、錨定橋接、PCR擴增、單堿基延伸測序和數(shù)據(jù)分析。研究者根據(jù)測序儀捕獲到在測序過程中摻入有不同熒光標記堿基片段,經(jīng)計算機將熒光信號轉(zhuǎn)化成不同顏色的測序峰圖和堿基序列?；驕y序結(jié)果與NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫、千人基因組數(shù)據(jù)庫等國際權(quán)威數(shù)據(jù)庫比對,最終確定是否為突變基因。自NGS技術(shù)問世以來,利用WES在臨床疾病致病基因的鑒定研究中取得前所未有的成果。這些成果不僅集中在單基因遺傳疾病,還在多基因影響的

7、復雜疾病中獲得大量相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)。在單基因遺傳性疾病中,如視網(wǎng)膜色素變性、終端骨發(fā)育不良等發(fā)現(xiàn)新基因或已知基因新突變。在一些罕見的疾病中,如Kabuki綜合征、家族性混合型低脂血癥和脊髓小腦共濟失調(diào)癥等疾病中發(fā)現(xiàn)新的致病基因。同時,在小細胞肺癌、慢性淋巴細胞性白血病等腫瘤研究和諸如肥胖癥、腦皮質(zhì)發(fā)育不良等復雜疾病的研究中也取得豐碩成果。