DB21∕T 2252-2014 O型口蹄疫病毒RT-PCR檢測方法

《DB21∕T 2252-2014 O型口蹄疫病毒RT-PCR檢測方法》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。

1、ICS11.220B41DB21遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)DB21/T2252—2014Ｏ型口蹄疫病毒RT-PCR檢測方法MethodofRT-PCRforthedetectionoftypeOfootandmouthdiseasevirus2014-03-07發(fā)布2014-05-07實施遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB21/T2252—2014Ｏ型口蹄疫病毒RT-PCR檢測方法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了Ｏ型口蹄疫病毒（FMDV-O）RT-PCR檢測方法的實驗材料、儀器設(shè)備、試劑、操作步驟和結(jié)果判定，并介紹了其原理。本標(biāo)準(zhǔn)適用于動物及動物產(chǎn)品中Ｏ型口蹄疫病毒的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是

2、必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682-1992分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第302號獸醫(yī)實驗室生物安全技術(shù)管理規(guī)范3縮略語下列縮略語適用于本標(biāo)準(zhǔn)。DEPC焦炭酸二乙酯RNA核糖核酸RT-PCR反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)dNTP脫氧核苷酸三磷酸bp堿基對Ｏ-P液牛、羊食道-咽部分泌物4原理FMDV是一種RNA病毒。RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA可作為PCR模板進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)FMDV-O保守基因序列設(shè)計一對引物，在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以引物為延伸

3、起點，通過變性、退火和延伸，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA。5實驗材料、儀器設(shè)備和試劑5.1實驗材料眼科剪、眼科鑷、稱量紙、1.5mL滅菌離心管（經(jīng)DEPC水處理）、0.2mL薄壁PCR管、瓊脂糖、500mL量筒、500mL三角瓶、吸頭（10μL、200μL、1000μL）。5.2儀器設(shè)備1DB21/T2252—2014分析天平、低溫高速離心機(jī)、PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀（或紫外分析儀）、－70℃冰箱、微波爐、組織研磨器、－20℃冰箱、可調(diào)移液器（最大量程分別為2μL、20μL、200μL、1000μL）。5.3試劑5.3.12.5mmol/LdNTP。

4、5.3.2引物：上游引物5′-AGATTTGTGAAAGTAACACCA-3′，下游引物5′-CATGTCCTCTTGCATCTGGTT-3′。5.3.310倍PCR緩沖液。5.3.41%溴化乙錠（EB）溶液（見第A.1）。5.3.5電泳緩沖液（50倍）（見第A.2）。5.3.61%瓊脂糖凝膠（見第A.3）。5.3.775%乙醇（見第A.4）。5.3.8滅菌DEPC水（見第A.5）。5.3.9上樣緩沖液(見第A.6)。5.3.10電泳緩沖液（1倍）（見第A.7）。5.3.11磷酸鹽緩沖液（0.04mol/L、pH7.4）（見第A.8）。5.3.12其他試劑：10U/μLAMV反轉(zhuǎn)錄酶

5、、50U/μLRNA酶抑制劑、5U/μLTaqDNA聚合酶、異丙醇、25mmol/L氯化鎂溶液。注：除另有規(guī)定，所用試劑均為分析純，水為符合GB/T6682－1992的滅菌雙蒸水或超純水。6操作步驟6.1樣品的采集、保存運送和處理6.1.1樣品采集6.1.1.1水泡液：未破裂水泡中的水泡液用滅菌注射器吸出后裝入滅菌小瓶中（可加青霉素1000UI/mL，鏈霉素1mg/mL），加蓋密封，編號。6.1.1.2水泡皮：剪取新鮮水泡皮3～5g放入滅菌小瓶中，加6～10mL（2倍體積）50％甘油－磷酸鹽緩沖液(0.04mol/L、pH7.4),加蓋密封，編號。6.1.1.3肌肉或組織樣品：無菌采

6、集淋巴結(jié)、脊髓、肌肉等組織樣品3～5g裝入潔凈的小瓶內(nèi)或其他滅菌容器，編號。6.1.1.4O-P液樣品：被檢動物在采樣前禁食(可飲水)12小時，以免反芻胃內(nèi)容物嚴(yán)重污染O-P液。采樣探杯在使用前經(jīng)0.2％檸檬酸或2％氫氧化鈉浸泡5min，再用自來水沖洗。每采完一頭動物,探杯要重復(fù)進(jìn)行消毒和清洗。采樣時動物站立保定，將探杯隨吞咽動作送入食道上部10～15cm處，輕輕來回移動2～3次，然后將探杯拉出。如采集的O-P液被反芻胃內(nèi)容物嚴(yán)重污染，要用生理鹽水或自來水2DB21/T2252—2014沖洗口腔后重新采樣。將探杯采集到的8～10mLO-P液倒入25mL以上的滅菌玻璃容器中,容器中應(yīng)事

7、先加有8～10mL細(xì)胞培養(yǎng)液或磷酸鹽緩沖液(0.04mol/L、pH7.4)，加蓋密封后充分搖勻，編號。6.1.2樣品保存與運送6.1.2.1樣品保存：采集的樣品冷藏送檢或盡快冷凍保存，避免反復(fù)凍融。6.1.2.2樣品運送：樣品裝入保溫壺或保溫桶中加冷凍劑和防震材料，加蓋密封，以最快方式，運送到實驗室。按照《獸醫(yī)實驗室生物安全技術(shù)管理規(guī)范》進(jìn)行樣品的生物安全標(biāo)識。6.1.3樣品處理6.1.3.1水泡液：不需處理，可以直接進(jìn)行核酸提取。6.1.3.2水泡皮、