口蹄疫病毒O、A和Asia1型分型熒光RT-PCR檢測(cè)方法.pdf

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1、ICS11.220B41團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/CVMAX24—2019口蹄疫病毒O、A和Asia1型分型熒光RT-PCR檢測(cè)方法Real-TimeRT-PCRforDetectionofFootandMouthDiseaseVirusesserotypeO,AandAsia1（征求意見(jiàn)稿）CVMA中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)2019-xx-xx發(fā)布2019-xx-xx實(shí)施中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)發(fā)布T/CVMAX24—2019前言本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)不涉及專利。本標(biāo)準(zhǔn)由中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所、中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：劉湘濤、何

2、繼軍、林密、馬維民、楊光、楊亞民、高鵬程、靳野、鄭海學(xué)、郭建宏、王傳彬、劉玉良CVMA中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)IT/CVMAX24—2019口蹄疫病毒O、A和Asia1型分型熒光RT-PCR檢測(cè)方法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了口蹄疫病毒O、A和Asia1型分型熒光RT-PCR檢測(cè)技術(shù)要求和結(jié)果判定。本標(biāo)準(zhǔn)適用于臨床發(fā)病動(dòng)物水泡皮、水泡液、反芻動(dòng)物食道-咽部分泌物（O-P液）及其他組織和病毒培養(yǎng)物中口蹄疫病毒核酸檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物

3、安全通用要求GB/T18935口蹄疫診斷技術(shù)GB/T27528口蹄疫病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法3試劑3.1總RNA提取試劑CVMA3.1.1無(wú)核酶水：中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)將焦碳酸二乙酯（DEPC）按0.1%的量（w/v）加入三蒸水中制備的無(wú)DNA酶和RNA酶水（附錄A.1）。推薦使用商品化無(wú)核酶水。3.1.2Trizol裂解液：商品化試劑，4℃保存。3.1.3三氯甲烷：分析純，常溫保存。3.1.4異丙醇：分析純，常溫保存。使用前預(yù)冷至-20℃。3.1.575%乙醇：無(wú)水乙醇（分析純）與無(wú)核酶水按3:1配制而成。使用前預(yù)冷至-20℃。2T/CVMAX24—20193.1.6核酸提取等效方法和

4、試劑：可采用等效RNA提取方法，如采用離心柱、磁珠法、自動(dòng)化核酸提取儀等提取核酸，分別使用配套試劑。3.2Real-timeRT-PCR試劑2×Real-timeRT-PCR緩沖液、熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶(5U/μL)、PrimeScript反轉(zhuǎn)錄酶混合液、RNA酶抑制劑（40U/μL）。3.3引物和探針序列O型上游引物序列為：5’-GCTCTTTCCCCACCAGTTCA-3’；下游引物序列為：5’-TTGTACTGGTCGTAGCGGTTGA-3’；探針序列為：5’-CGGACGAACATGACGGCGCACA-3’，其5’端和3’端分別標(biāo)記FAM和BHQ。A型分型上游引物序列為：

5、5’-TTGCACTTCATGTTTACTGGCT-3’；下游引物序列為：5’-CGTGTCCCATTCTGCGTGG-3；探針序列為：5’-ACGCCACCGGACACACCTGAGAA-3’，其5’端和3’端分別標(biāo)記CY5和BHQ。Asia1型分型上游引物序列為：5’-CCGACGGCTTCACACTGA-3’；下游引物序列為：5’-AGAAGTAGTACGTCGCAGACC-3’；探針序列為：5’-CTCACCCAGCCCAAGAGCACCC-3’，其5’端和3’端分別標(biāo)記HEX和BHQ。配制反應(yīng)體系時(shí)，3條上游引物、3條下游引物和3條探針?lè)謩e等量混合，成為混合上游引物、混合下游引

6、物和混合探針。CVMA3.4陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)3.4.1陽(yáng)性對(duì)照：口蹄疫病毒培養(yǎng)物滅活抗原。3.4.2陰性對(duì)照：無(wú)核酶水。4主要儀器設(shè)備熒光PCR儀、組織勻漿器、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)、生物安全柜等。5操作步驟3T/CVMAX24—20195.1樣品采集樣品采集按照GB/T189355.3進(jìn)行。5.2樣品處理5.2.1生物安全措施：樣品處理過(guò)程中的生物安全要求和措施，按照GB19489進(jìn)行。5.2.2組織樣品處理：將采集的發(fā)病動(dòng)物病料或組織，置組織勻漿器中充分研磨，0.04mol/LPBS（pH7.4）（附錄A.2）制成1:5~1:10組織懸液，4℃浸毒，3000r/min離心1

7、0min，取上清液備用。5.2.3水泡液、O-P液樣品處理：直接用于檢測(cè)。5.2.4病毒培養(yǎng)物：病毒接種本動(dòng)物、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后的發(fā)病病料等組織樣品，按照5.2.2處理。病毒接種細(xì)胞培養(yǎng)物直接檢測(cè)。5.3病毒RNA提取5.3.1若使用傳統(tǒng)的Trizol裂解方法提取病毒RNA，參照以下步驟進(jìn)行操作。5.3.1.1取已處理的待檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照各200μL，分別置于1.5mL離心管中，每管加入1000μLTrizol裂解液，充分混勻，