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《口蹄疫病毒O、A和Asia1型分型熒光RT-PCR檢測(cè)方法.pdf》由會(huì)員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、ICS11.220B41團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/CVMAX24—2019口蹄疫病毒O、A和Asia1型分型熒光RT-PCR檢測(cè)方法Real-TimeRT-PCRforDetectionofFootandMouthDiseaseVirusesserotypeO,AandAsia1(征求意見(jiàn)稿)CVMA中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)2019-xx-xx發(fā)布2019-xx-xx實(shí)施中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)發(fā)布T/CVMAX24—2019前言本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)不涉及專利。本標(biāo)準(zhǔn)由中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所、中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人:劉湘濤、何
2、繼軍、林密、馬維民、楊光、楊亞民、高鵬程、靳野、鄭海學(xué)、郭建宏、王傳彬、劉玉良CVMA中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)IT/CVMAX24—2019口蹄疫病毒O、A和Asia1型分型熒光RT-PCR檢測(cè)方法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了口蹄疫病毒O、A和Asia1型分型熒光RT-PCR檢測(cè)技術(shù)要求和結(jié)果判定。本標(biāo)準(zhǔn)適用于臨床發(fā)病動(dòng)物水泡皮、水泡液、反芻動(dòng)物食道-咽部分泌物(O-P液)及其他組織和病毒培養(yǎng)物中口蹄疫病毒核酸檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物
3、安全通用要求GB/T18935口蹄疫診斷技術(shù)GB/T27528口蹄疫病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法3試劑3.1總RNA提取試劑CVMA3.1.1無(wú)核酶水:中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)將焦碳酸二乙酯(DEPC)按0.1%的量(w/v)加入三蒸水中制備的無(wú)DNA酶和RNA酶水(附錄A.1)。推薦使用商品化無(wú)核酶水。3.1.2Trizol裂解液:商品化試劑,4℃保存。3.1.3三氯甲烷:分析純,常溫保存。3.1.4異丙醇:分析純,常溫保存。使用前預(yù)冷至-20℃。3.1.575%乙醇:無(wú)水乙醇(分析純)與無(wú)核酶水按3:1配制而成。使用前預(yù)冷至-20℃。2T/CVMAX24—20193.1.6核酸提取等效方法和
4、試劑:可采用等效RNA提取方法,如采用離心柱、磁珠法、自動(dòng)化核酸提取儀等提取核酸,分別使用配套試劑。3.2Real-timeRT-PCR試劑2×Real-timeRT-PCR緩沖液、熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶(5U/μL)、PrimeScript反轉(zhuǎn)錄酶混合液、RNA酶抑制劑(40U/μL)。3.3引物和探針序列O型上游引物序列為:5’-GCTCTTTCCCCACCAGTTCA-3’;下游引物序列為:5’-TTGTACTGGTCGTAGCGGTTGA-3’;探針序列為:5’-CGGACGAACATGACGGCGCACA-3’,其5’端和3’端分別標(biāo)記FAM和BHQ。A型分型上游引物序列為:
5、5’-TTGCACTTCATGTTTACTGGCT-3’;下游引物序列為:5’-CGTGTCCCATTCTGCGTGG-3;探針序列為:5’-ACGCCACCGGACACACCTGAGAA-3’,其5’端和3’端分別標(biāo)記CY5和BHQ。Asia1型分型上游引物序列為:5’-CCGACGGCTTCACACTGA-3’;下游引物序列為:5’-AGAAGTAGTACGTCGCAGACC-3’;探針序列為:5’-CTCACCCAGCCCAAGAGCACCC-3’,其5’端和3’端分別標(biāo)記HEX和BHQ。配制反應(yīng)體系時(shí),3條上游引物、3條下游引物和3條探針?lè)謩e等量混合,成為混合上游引物、混合下游引
6、物和混合探針。CVMA3.4陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)3.4.1陽(yáng)性對(duì)照:口蹄疫病毒培養(yǎng)物滅活抗原。3.4.2陰性對(duì)照:無(wú)核酶水。4主要儀器設(shè)備熒光PCR儀、組織勻漿器、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)、生物安全柜等。5操作步驟3T/CVMAX24—20195.1樣品采集樣品采集按照GB/T189355.3進(jìn)行。5.2樣品處理5.2.1生物安全措施:樣品處理過(guò)程中的生物安全要求和措施,按照GB19489進(jìn)行。5.2.2組織樣品處理:將采集的發(fā)病動(dòng)物病料或組織,置組織勻漿器中充分研磨,0.04mol/LPBS(pH7.4)(附錄A.2)制成1:5~1:10組織懸液,4℃浸毒,3000r/min離心1
7、0min,取上清液備用。5.2.3水泡液、O-P液樣品處理:直接用于檢測(cè)。5.2.4病毒培養(yǎng)物:病毒接種本動(dòng)物、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后的發(fā)病病料等組織樣品,按照5.2.2處理。病毒接種細(xì)胞培養(yǎng)物直接檢測(cè)。5.3病毒RNA提取5.3.1若使用傳統(tǒng)的Trizol裂解方法提取病毒RNA,參照以下步驟進(jìn)行操作。5.3.1.1取已處理的待檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照各200μL,分別置于1.5mL離心管中,每管加入1000μLTrizol裂解液,充分混勻,