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《一株水貂犬瘟熱病毒的分離與鑒定》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、一株水貂犬瘟熱病毒的分離與鑒定摘要2013年7刀，臨沂諸城某水貂養(yǎng)殖場發(fā)生傳染病一例，養(yǎng)殖場規(guī)模大約在7000只左右，平均每天死亡十幾只，對(duì)養(yǎng)殖戶造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。臨床癥狀為精神萎靡，食欲不振，眼、辱流出黏性分泌物，個(gè)別嚴(yán)重病例發(fā)生腹瀉，伴有神經(jīng)癥狀。剖檢可見帥臟出血嚴(yán)重，腸粘膜脫落，肝臟有針尖狀出血點(diǎn)、質(zhì)脆易碎。采集發(fā)病水貂的肝、脾、肺、腦等組織，通過RT-PCR檢測確定是犬瘟熱病毒(CDV),測序分析發(fā)現(xiàn)：該病毒與NCBI上發(fā)布的登錄號(hào)為EF042819、KC590511、KC667070的毒株同源性均為
2、96%以上，將陽性樣品接種Vero細(xì)胞，通過細(xì)胞培養(yǎng)傳代獲得病毒一株，并命名為CDV-SDo關(guān)鍵詞：水貂犬瘟熱病毒RT-PCR細(xì)胞培養(yǎng)OnecaseofminkforisolationandidentificationofCaninedistempervirusAbstract:July2013,onecaseofinfectiousdiseaseoccurredinaminkfarminLinyi.About7000minkswereinthisfarmwhileadozenofminksweredeadda
3、ily,whichcausedgreateconomiclossesforthefarmers.Theclinicalperformanceswerelistlessnessjossofappetite.stickysecretionswitheyesandnose.someseriouswithdiarrheaandNeurologicalsymptoms.Aftertheminkwasdissected,thelunghemorrhage,intestinalmucosalsheddingandlivern
4、eedle-likebleeding,brittleandfragilewereappearedinthemainpathologicalchanges.TheLiver,spleen,lungandbrainwerecollectedandconfirmedCDVbytheassayofRT-PCR.ScqucncingAnalysisreleasedthatthevimsweremorethan96%homologywiththeoneswhoseGenBanknumberswereEF042819、KC5
5、90511andKC667070onNCBI.ByinfectingtheVerocellwiththepositivesample,wegotoneviruscalledCDV-SDKeywords:Mink;CDV;RT?PCR;Cellculture犬瘟熱是由犬瘟熱病毒引起的犬和食肉目小許多動(dòng)物的一種高度接觸傳染性傳染病。犬瘟熱病毒屬于副黏病毒科麻疹病毒屬，基因?yàn)閱喂韶?fù)鏈RNA。在室溫下，該病毒相對(duì)不穩(wěn)定，尤其對(duì)紫外線、干燥及50?60°C以上的高溫敏感。病毒可在犬腎、牛腎、雞胚成纖維細(xì)胞及Vero細(xì)胞上
6、生長繁殖。在研究屮Vero細(xì)胞是增殖病毒的首選細(xì)胞，CDV會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)CPE,表現(xiàn)胞漿出現(xiàn)空泡、細(xì)胞逐漸圓縮，甚至拉網(wǎng)，最后脫落死亡。1、材料與方法1.1材料1.1.1試劑與儀器TaKaRa一步法RT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司；核酸提取試劑盒購自AXYGEN；MEM培養(yǎng)基和胎牛血清均購0HyClone公司(美國);PCR儀為Eppendorf公司生產(chǎn)；凝膠成像與分析儀購自Bio-RAD；Vcro細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存1.1.2引物信息引物序列：CDV15，?GGTTTACCCTTGGTGGTTAGT?3'
7、CDV25，?ATGGTGCCTGCTTTGGTC?3'1?2樣品的采集及處理無菌采集水貂的①肺臟、肝肌、脾臟②腸③腦，分別放到三支干凈的離心管小剪碎，然后加入PBS適量，反復(fù)凍融三次，4°C,6000卬m/min,離心2分鐘，取上清，?80°C保存?zhèn)溆谩?.3RT-PCR檢測病毒基因組總RNA的捉取按AXYGEN核酸捉取試劑盒的說明進(jìn)行。犬瘟熱病毒RT-PCR反應(yīng)體系為：CDVI(20gM)0.5yL,CDV2(20yM)0.5yL,EnzymesMix12gL,RNA3yL,加ddHzO補(bǔ)足25yL體系,將
8、體系混勻置于PCR儀中，設(shè)定程序?yàn)椋?0°C30min,94°C2min,94°Clmin,55°Clmin,72°Clmin,33個(gè)循環(huán)，72°C延伸lOmin,取6
9、iL反應(yīng)產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上電泳。1.4病毒序列測定將病毒核酸送至上海生工進(jìn)行克隆測序，選取測序結(jié)果的N基因部分氨基酸序列與NCBI上發(fā)表的登錄號(hào)分別為EF042819、KC59051RKC667070的氨基酸序列進(jìn)
