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1、摘要水稻是世界上最重耍的糧食作物Z-,為約40%的人口捉供了主要食糧。蟲害是造成水稻減產減收的主要原因Z-O水稻蟲害種類繁多，我國每年因蟲害造成的產量損失占到水稻總產量的5%以上，給水稻的生產帶來了極大危害。目前，我國控制水稻蟲害最主要的方法是使用化學殺蟲劑，但化學防治帶來一系列問題，如環(huán)境污染,生產成本提高和食用安全性降低等。因此，通過培育口身能夠抵抗蟲害的水稻品種來防治水稻蟲害無疑是最經(jīng)濟安全的冇效策略。從已冇的研究來看，僅依靠常規(guī)育種難以解決抗蟲種質資源稀缺的問題，因此，通過基因工程手段導入外源抗蟲基因，進而培育抗蟲轉基因水稻越來越受到人們的重視。近年來轉Bt基因
2、抗蟲水稻已經(jīng)在生產上得到了廣泛的應用，隨著抗蟲轉基因水稻的大規(guī)模種植，Bt基因抗蟲譜相對狹窄及害蟲易產生耐受性等問題相繼引起了人們的關注。因此，從自然界中分離克隆岀更多、更冇效的基因成為解決這些問題的方法Z—。制稻是亞洲栽培稻的重要亞種，全世界水稻栽培品種中冇80%以上屬于制稻，其組織培養(yǎng)研究具有重要意義。而制稻的組培特性普遍較差，再牛率很低，導致一些生產上應用價值較大的優(yōu)良晶種轉化仍然難以成功或轉化頻率低，因而研究優(yōu)質釉稻的愈傷組織形成和植株再生能力對丁遺傳轉化率捉高十分必耍。農桿菌介導法因具有轉化拷貝數(shù)低等獨特的優(yōu)勢，而廣泛應用于轉基因抗蟲水稻研究中。然而，水稻不同
3、品種間遺傳差異性比較人，11轉化反應對水稻基因型依賴性強，從而增加了農桿菌介導的水稻遺傳轉化的復雜性和隨機性。因此，通過對農桿菌介導的水稻轉化休系的優(yōu)化提高轉化率十分必要。本研究主要進行了以下方而的工作：1.在新型Bt基因Cry30Fal和刃序列的兩端分別增加酶切位點序列，送基因合成公司合成，然后將目的基因片段與中間克隆載體pUPROK分別進行雙IW切，連接，獲得含口的基因的屮間載體。測序鑒定得到序列正確的陽性載體，用內切酶切下目的基因片段并插pCDMAR-Hyg載體，最終獲得高效表達雙元載體pCDMAR-Cry30Fa1-Hyg與pCDMA^C^54Aal-Hyg,并
4、通過酶切和測序的方法鑒定出上述載體的止確性。2.通過對愈傷組織繼代次數(shù)與繼代培養(yǎng)基中加入抗壞血酸（Vc）濃度的優(yōu)化，調整愈傷組織生長狀態(tài)，提高胚性愈傷組織數(shù)量。結果表明R125與R818的愈傷組織繼代2?3次，分化率最高；繼代培養(yǎng)基中加入Vc濃度為40mg/L,能減少愈傷組織褐化率月?對英分化能力無影響。1.通過對洗菌后及分化前愈傷組織的干燥處理，改良農桿菌介導的水稻遺傳轉化體系。結果表明洗菌后進行干燥及分化前愈傷組織在濾紙上干燥2天，能夠加快分化速度，提高分化率。2.農桿菌介導法將外源基因Cry30Fa1與Cvy54al轉入三系恢復系R125與R818屮，通過PCR
5、檢測與潮霉素溶液檢測轉基因植株。結果表明Cry3OFal與Cry54Aal轉R125未獲得轉基因陽性植株；Cry54Aal轉R818也未獲得轉基因陽性植株；Cry30Fcil轉R818共獲得233株轉基因再生植株，經(jīng)過潮霉索溶液檢測和分子檢測，其中46株為含目的基因的陽性植株。關鍵詞：釉稻；Cry30Fal基因；Cry54Aal基因；抗蟲；農桿菌介導法AbstractRiceisoneofthemostimportantgraincropsintheworld,forabout40%oftheworld'spopulationtakingitastheirstaplef
6、ood.However,insectdamageisoneofthemainreasonstodecreasethericeyield.TherearealargevarietyofricepestsinChina.Thericeproductionlossismorethan5%oftotalyieldbecauseofinsectdamage.Atpresent,themainmethodtocontrolricepestistoutilizechemicalpesticides?However,itcausedalotofproblems,suchasenviro
7、nmentalpollution,higherproductioncost,foodsafety,etc.Breedingnewricevarietiesthatproduceinsecticidalproteinsbythemselvesisundoubtedlythemosteconomicalandsecuritystrategy.Onthebasisofpreviousreports,itisdifficulttosolvetheproblembytraditionalbreedingbecauseofricegennplasni
