菌種劃種LB瓊脂平板檢查標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

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1、修訂日期修訂單號(hào)修訂內(nèi)容摘要頁(yè)次版次修訂審核批準(zhǔn)2011/03/30/系統(tǒng)文件新制定4A/0///批準(zhǔn):審核:編制:更多免費(fèi)資料下載請(qǐng)進(jìn)：好好學(xué)習(xí)社區(qū)依據(jù)：《中華人民共和國(guó)線典》2005年版第三部。范圍：適用于大腸桿菌表達(dá)的重組人基因工程產(chǎn)品。目的：檢查該菌種的菌落形態(tài)是否與標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌菌落形態(tài)一致，并檢查是否染冇雜菌。原理：將該菌種在LB瓊脂平板上劃線分離培養(yǎng)，以檢查菌落形態(tài)以及是否染有雜菌。內(nèi)容：1材料1.1材料1.1.1菌種:PBV3DFU,來(lái)源于主種子批或工作種子批。1.1.2注射用水：符合《中華人民共和國(guó)藥典》20

2、05年版的要求。1.1.3藥品氯化鈉NaCl分析純瓊脂粉分析純酵母粉蛋白膿無(wú)水乙醇CH3CH2OH分析純1.1.4器血平皿、三角燒瓶(3L)、量筒(1L)、玻棒、試劑瓶。1.1.5其它材料線繩、牛皮紙、硫酸紙、剪刀、接種環(huán)、煤氣燈。1.2儀器設(shè)備生物安全臺(tái)II級(jí)A型安徽蚌埠凈化設(shè)備廠恒溫培養(yǎng)箱IIG303-5B型湖北省黃石市醫(yī)療器械廠扭力天平TN-100B型上海第二天平廠2方法2.1準(zhǔn)備工作2.1.1生產(chǎn)環(huán)境：在十萬(wàn)級(jí)潔凈間進(jìn)行。場(chǎng)地摘下“清場(chǎng)合格”標(biāo)志牌，掛“使用中”標(biāo)志牌。2.1.2器皿的潔凈要求玻璃器血經(jīng)洗刷組處理完畢

3、后，用硫酸紙及牛皮紙包好，用線繩系緊，送高壓滅菌（121.3C60分鐘）。脫脂棉用硫酸紙、牛皮紙包好，高壓滅菌121.3C60分鐘。2.1.3調(diào)試儀器設(shè)備2.1.3.1確認(rèn)扭力天平運(yùn)行狀態(tài)良好，已掛有“備用”標(biāo)志牌。2.1.3.2確認(rèn)恒溫培養(yǎng)箱運(yùn)行狀態(tài)良好已掛有“運(yùn)行”標(biāo)志牌。2.1.3.3確認(rèn)生物安全臺(tái)運(yùn)行狀態(tài)良好己掛有“備用”標(biāo)志牌。2.2溶液的配制2.2.1LB瓊脂培養(yǎng)基的配制1000ml摘下扭力天平“備用”標(biāo)志牌，掛上“運(yùn)行”標(biāo)志牌。用扭力天平稱取酵母粉5克，蛋白腺10克,NaCl10克，瓊脂粉20克,倒入三角燒瓶中

4、,加注射用水1000ml,用玻棒攪勻,分別用硫酸紙、牛皮紙包口，用線繩扎緊，標(biāo)明名稱、配制時(shí)間，115.6C30分高壓滅菌。2.2.275%酒精溶液1000ml取750ml無(wú)水乙醇，加注射用水定容1000ml,混勻，裝入試劑瓶中，貼標(biāo)簽，標(biāo)明液體名稱、濃度、配制日期，室溫備用。2.3操作步驟2.3.1摘下生物安全臺(tái)“備用”標(biāo)志牌，掛上“運(yùn)行”標(biāo)志牌。用75%酒精棉擦拭臺(tái)內(nèi)，接通電源，打開(kāi)風(fēng)機(jī)，無(wú)菌風(fēng)吹30分鐘，待已滅菌LB瓊脂培養(yǎng)基冷卻至50°C左右，倒平板，每皿20-30ml,待凝固后，放入恒溫培養(yǎng)箱中，37°C倒置培養(yǎng)2

5、4小時(shí)，如無(wú)雜菌生長(zhǎng)，即可繼續(xù)實(shí)驗(yàn)用。2.3.2劃線分離：用接種環(huán)（經(jīng)火焰滅菌，冷卻后）取1環(huán)菌種于LB平板上劃線分離。2.3.3將劃線分離的平板置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。2.3.4操作結(jié)束后，場(chǎng)地摘下“使用中”標(biāo)志牌，掛上“待處理”標(biāo)志牌。3結(jié)果判定3.1判定標(biāo)準(zhǔn)：菌落形態(tài)如為圓形，濕潤(rùn)、光滑，中等大小（直徑約2-3mm）,即為典型大腸樸菌菌落。3.2判定結(jié)果判定結(jié)杲經(jīng)二人復(fù)核后，填寫(xiě)檢定記錄，注明菌種名稱、批號(hào)、判定日期、檢定結(jié)杲、工作者及復(fù)核者等。4清場(chǎng)4.1配液清場(chǎng)4.1.1藥品稱量Z后，將藥品瓶蓋緊，放

6、回原處。4.1.2將扭力天平處理干凈，放回原處。摘卜?“運(yùn)行”標(biāo)志牌，掛上“備用”標(biāo)志牌。并填寫(xiě)使用記錄。4.1.3生物安全臺(tái)內(nèi)用75%酒精棉擦拭干凈，繼續(xù)吹10分鐘后，關(guān)閉風(fēng)機(jī)，切斷電源，摘下“運(yùn)行”標(biāo)志牌，掛上“備用”標(biāo)志牌，并填寫(xiě)使用記錄。4.1.4操作臺(tái)而用專用抹布擦干凈。4.2操作清場(chǎng)4.2.1將帶冇細(xì)菌的LB平板送高壓滅菌（121.3°C60分鐘），滅菌后將平皿內(nèi)容物倒入垃圾桶中。4.2.2玻璃器血用純化用水沖洗干凈，送本室洗刷組處理。4.2.3清場(chǎng)合格后，由車間工序負(fù)責(zé)人或質(zhì)量監(jiān)督員檢查合格后，摘下“待處理”標(biāo)

7、志牌，“清場(chǎng)合格”標(biāo)志牌，并填寫(xiě)清場(chǎng)記錄。5注意事項(xiàng)5.1清場(chǎng)吋，必須將帶有細(xì)菌的平板先送高壓滅菌處理后再送到洗刷組處理。5.2所有工作均應(yīng)二人復(fù)核，并填寫(xiě)工作記錄。