DC-CIK細胞治療流式質(zhì)量控制

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1、DC-CIK細胞治療流式質(zhì)量控制腫瘤的細胞免疫治療主要是通過主動或被動調(diào)動宿主天然防衛(wèi)機制來取得抗腫瘤的效應。具體表現(xiàn)為干擾細胞生長、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)移的直接抗瘤作用或通過激活免疫系統(tǒng)的效應細胞及其所分泌的因子來達到對腫瘤殺傷或抑制的目的。腫瘤的治療是多種治療手段的綜合運用，細胞治療是其中的一個重要治療手段，其主要作用為：減少惡性腫瘤傳統(tǒng)治療后的復發(fā)與轉(zhuǎn)移；提高腫瘤綜合治療療效。對放化療不敏感或者無法耐受的情況以及對免疫原性較強的的腫瘤的少數(shù)腫瘤及患者可以考慮以細胞治療為其主要治療手段。腫瘤的細胞免疫治療屮，DC/CIK治療方案因其高效的殺瘤活性被認為是最有前途的腫瘤免疫治療手段之一。DC與CIK

2、共培養(yǎng)構(gòu)成了一個體外活化免疫體系回輸后能夠有效地抵抗癌細胞對免疫細胞的抑制作用，發(fā)揮更持久的殺瘤活性。細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-inducedkillercells,CIK),是單個核細胞經(jīng)過多種細胞因子(如IL?2,INF?Y，CD3單克隆抗體等)刺激，產(chǎn)生的一群以CD3+CD56+為主的一群異質(zhì)細胞，兼有T細胞強大的抗腫瘤活性和NK細胞非MHC限制性殺腫瘤特點。其來源包括CD3+CD56-T淋巴細胞，CD4-CD8+T淋巴細胞，以及CD4-CD8-T細胞。主要通過以下3種途徑發(fā)揮其抗腫瘤活性:1).直接識別并殺傷腫瘤細胞；2)?通過分泌細胞因子、提高機體免疫功能抑制腫瘤

3、細胞的生長；3)?通過誘導腫瘤細胞的凋亡抑制腫瘤生長。樹突狀細胞(dendriticcells’DC)能捕獲細菌、病毒等抗原，并遞呈給次級淋巴器官的T細胞，是天然免疫和適應性免疫連接的一個重要紐帶。DC既能誘導初級免疫反應，又能誘導次級免疫反應，是啟動、調(diào)控、并維持免疫應答的中心環(huán)節(jié).是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強的抗原提呈細胞，成熟DC細胞可有效誘導抗原特異性T細胞增殖和活化，是機體抗腫瘤免疫的主要啟動者和參與者。可由外周血單核細胞，通過加入GM-CSF,IL-4,TNF-a等刺激因子刺激培養(yǎng),分化為DC細胞,再用腫瘤抗原刺激提高DC對特定腫瘤細胞的識別能力。無論是單獨應用DC細胞的主動免疫治療、

4、CIK細胞的過繼免疫治療，還是常規(guī)治療后聯(lián)合這兩種方法進行的輔助治療，在腫瘤的免疫治療中，都顯示岀了廣泛的應用潛力。為了確?；剌?shù)募毎_到可接受的質(zhì)量標準，無污染，保證其安全，各國都制定了細胞治療的規(guī)范和標準。如2003年，中國食品藥品監(jiān)督管理局頒布《人體細胞治療研究和制劑質(zhì)量控制技術(shù)指導原則》；2009年，國家衛(wèi)生部對第三類醫(yī)療技術(shù)準入管理制定《自體免疫細胞仃細胞、NK細胞)治療技術(shù)管理規(guī)范》等文件規(guī)定，體外刺激培養(yǎng)擴增后回輸?shù)募毎杞?jīng)過嚴格的質(zhì)控過程，如細菌、真菌、支原體和內(nèi)毒素檢測，細胞數(shù)量和活性，以及生物學效應檢測。使用流式細胞儀進行免疫表型分析是重要生物學效應檢測鑒定方式。DC細

5、胞流式質(zhì)量控制目的：對PBMC和DC表型鑒定，對DC細胞均一性進行分析。細胞表型鑒定是DC質(zhì)量控制指標Z-,需比較DC在刺激分化前后的分子標記表達情況，鑒定DC細胞成熟情況。細胞均一性分析DC細胞質(zhì)量控制的指標之一，需要檢測T淋巴細胞分子標記選擇CD3,B淋巴細胞分子標記CD19,單核/巨噬細胞分析標記CD14,自然殺傷細胞CD16/CD56,樹突細胞標記HLA-DR,CDla,CD80,CD86,CDllc,CD83,CCR7,CD40,CD54等。材料：流式上樣管PBMC細胞8dDC細胞熒光素標記單克隆抗體(HLA-DR,CDla,CD80,CD86,CDllc,CD83,CD54,C

6、D40,CD14,CD3,CD19,CD16)及同型對照抗體，PBS臺式冷凍離心機移液槍及槍頭方法：一?細胞流式樣本制備1.將PBMC或者8天DC細胞收集至15ml離心管,1200rpm,4°C,離心lOmin；2.棄上清。用PBS重懸細胞，充分打勻后計數(shù)。根據(jù)計數(shù)結(jié)果，將細胞密度調(diào)整到1-2X106/ml,制成細胞懸液；1.取流式管加入lOOul細胞懸液；2.設(shè)置單色/雙色或者多色分析檢測管和同型對照管；3.PBMC表型分析：取流式管加入lOOulPBMC細胞懸液(1?2X”/ml)。每支流式管分別加入5-20ul(根據(jù)抗體說明書用量指導)抗體(HLA-DR,CDla,CD80,CD86

7、,CDllc,CD83,CD40,CD54,CD14),以及同型對照抗體；4.DC細胞表型和均一性分析:取流式管加入lOOulPBMC細胞懸?(l-2X106/ml)每支流式管分別加入5-20UI(根據(jù)抗體說明書用量指導)對應抗體，如CD3/CD86,CD19/CDla,CD14/CD80,CDllc/HLA-DR,CD40/CD83,CD16/CD54等；5.同時設(shè)定單染管，調(diào)節(jié)熒光通道間熒光補償；6.4°C,避光孵育