禽巴氏桿菌病病原的分離與鑒定(以發(fā)表)

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1、禽巴氏桿菌病病原的分離與鑒定（以發(fā)表）禽巴氏桿菌病病原的分離與鑒定（***動(dòng)物疫病預(yù)防控制屮心***）禽巴氏桿菌病又叫禽霍亂和禽出血性敗血癥，是禽類的一種常見接觸性敗血性傳染病，各種類型的禽均可感染并導(dǎo)致死亡。其特征表現(xiàn)為急性敗血過程，發(fā)病率和死亡率都很高。低毒感染或急性發(fā)病之后，可岀現(xiàn)慢性的、局部性的疾病。（一）、病原1、形態(tài)染色禽巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌引起的，多殺性巴氏桿菌為卵圓形的短小桿菌，少數(shù)近于球形，長(zhǎng)約0.6-2.5um（微米），寬約0.2~0.4um,無鞭毛，不能運(yùn)動(dòng)，不形成芽胞。革蘭氏染色陰性，多呈單個(gè)或成對(duì)存在。在組織，血液和新分離培養(yǎng)物中的菌體用美藍(lán)、瑞氏

2、、姬姆薩氏法染色均可著色，菌體呈明顯的倆極著色，中間部分著色較淺，很像許多并列的兩個(gè)球菌，所以乂叫兩極桿菌。血清型菌株有莢膜，用印度墨汁等染料染色時(shí)，可以見到清晰的莢膜。人工培養(yǎng)后及弱毒株，莢膜不明顯或消失。2、培養(yǎng)特征巴氏桿菌為需氧兼性厭氧菌。在普通培養(yǎng)基上可生長(zhǎng)，37°C培養(yǎng)18-24h（小時(shí)），可見灰白色，半透明，光滑，濕潤(rùn)，隆起，邊緣整齊的露滴狀小菌落，直徑約1-2mm（毫米）。木菌在鮮血瓊脂，血清瓊脂或馬丁瓊脂平皿上培養(yǎng)，生長(zhǎng)良好，不溶血。在肉湯中培養(yǎng)時(shí)，初期呈均勻混濁，24h后上清清亮，管底有灰白色絮狀沉淀，輕搖時(shí)呈絮狀上升。新分離的細(xì)菌接種到馬丁瓊脂平皿上，通過45°

3、折光觀察，可見菌落有熒光,呈橘紅色帶金光，邊緣有乳口色光帶，結(jié)構(gòu)細(xì)致，邊緣整齊，稱為Fo型菌落，對(duì)雞等禽致病1力強(qiáng)；另一類菌落呈藍(lán)綠色而帶金光，邊緣有紅黃色光帶，稱為Fg型菌落，對(duì)雞等禽致病力較弱。該菌可利用果糖，甘露糖，蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；不能利用肌醇乳糖,靛基質(zhì)，過氧化氫酶，氧化酶和硝酸鹽還原陽性，尿素酶陰性，不液化明膠，在麥康凱培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)，普通瓊脂上發(fā)育不良或不發(fā)育。3、種類多殺性巴氏桿菌的抗原結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，分類方法有很多種，Garter在1955年用間接血凝試驗(yàn)根據(jù)細(xì)菌莢膜將其分為A、B、D、E四個(gè)型。Rimler于1987年又發(fā)現(xiàn)一種新的莢膜血清型F,[17]Namio

4、ka用鹽酸除去莢膜做交叉凝集試驗(yàn)，將該菌分為個(gè)菌體血清型。至此，本菌的血清型可以用莢膜血清型和菌體血清型合并表示，以阿拉伯?dāng)?shù)字表示菌體抗原，大寫英文字母表示莢膜抗原，如5：A。禽巴氏桿菌多屬A型，少數(shù)見于D型。經(jīng)我國(guó)學(xué)者對(duì)禽巴氏桿菌分型研究表明，我國(guó)流行的禽源巴氏桿菌大部分均為5：A、&A及9：Ao多殺性巴氏桿菌的莢膜與其毒力有關(guān)，有致病力的菌株如果失去產(chǎn)生莢膜的能力，可導(dǎo)致其毒力的丟失。已有研究表明多殺性巴氏桿菌在體內(nèi)繁殖可以產(chǎn)生毒素，內(nèi)毒素是其主要的毒力因子，引發(fā)病理過程。(%1)、禽巴氏桿菌的分離與鑒定⑴、病料采集：無菌操作采取死亡雞肝臟、脾臟、心臟，采病料時(shí)用燒紅的刀片燒烙

5、組織，而后用滅菌棉拭子或接種環(huán)通過燒烙表面插入組織或心臟內(nèi)取樣。(2)、涂片鏡檢：將肝觸片和心血涂片，滴加幾滴甲醇，作用2-3min,自然干燥，然后分別進(jìn)行革蘭氏染色和美蘭染色，鏡檢。(3)、禽巴氏桿菌分離與純化：無菌取急性死亡的雞的心血、肝分別接種血液瓊脂平板、麥康凱培養(yǎng)基2等培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)24ho觀察培養(yǎng)基變化情況并涂片鏡檢。然后再?gòu)难桨迳咸魡蝹€(gè)菌落接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯、厭氣肉肝湯觀察其生長(zhǎng)特性。最后從血平板上挑取疑為禽巴氏桿菌的單個(gè)菌落，在含4%血清和0.1%裂解全血的馬丁平板上劃線，37°C培養(yǎng)：L8h備用。(4)、禽巴氏桿菌的純度檢驗(yàn)：將菌株畫線接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基，

6、37°C培養(yǎng)18-24h后觀察。菌落形態(tài)一致的菌落，經(jīng)涂片，革蘭氏染色，鏡檢。(5)、禽巴氏桿菌的生化試驗(yàn)：將分離的細(xì)菌接種到血液瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)18-24h,挑取單取個(gè)菌落到乳糖、蔗糖、果糖、山梨醇、尿素酶、葡萄糖、麥芽糖的微量生化反應(yīng)管中，37°C培養(yǎng)24h后，觀察結(jié)果。注：附禽巴氏桿菌的生化試驗(yàn)鑒定標(biāo)準(zhǔn)表。表二：巴氏桿菌的生化試驗(yàn)鑒定標(biāo)準(zhǔn)表[19]水山甘尿葡麥?zhǔn)蟀朐嚾檎峁示彰魅闃永媛端靥蜒坷顒┨翘翘翘怯吞悄z背醇醇酶糖糖糖反應(yīng)-U++-++U+U+--+--U-“+”表示反應(yīng)，“■”表示無反應(yīng)，“U”表示通常，“V”表示不定。(2)、禽巴氏桿菌致病試驗(yàn)：將分離的細(xì)菌接

7、種營(yíng)養(yǎng)肉湯，37°C培養(yǎng)18-24h后，取5只小白鼠腹腔注射，每只0.1ml,另外取5只按同劑量腹腔注射生理鹽水做對(duì)照。觀察，有死亡小鼠則解剖取心血涂片鏡檢。(%1)、結(jié)果(1)、涂片鏡檢：可見菌體兩極濃染，中間部分著色較淺，革蘭氏染色為革蘭氏陰性小桿3菌。(2)、禽巴氏桿菌分離：血液瓊脂平板上生長(zhǎng)出稍突、白色、半透明、奶油狀、不溶血的菌落，營(yíng)養(yǎng)肉湯和厭氣肉肝湯混濁，麥康凱培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)。鏡檢為革蘭氏陰性、兩極著色的短小桿菌，多數(shù)單個(gè)存在。在含0.1%裂解全血和4%血