高通量測(cè)序及分析報(bào)告

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1、實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)高通量測(cè)序與功能分析微生物群落測(cè)序是指對(duì)微生物群體進(jìn)行高通量測(cè)序，通過(guò)分析測(cè)序序列的構(gòu)成分析特定環(huán)境中微生物群體的構(gòu)成情況或基因的組成以及功能。借助不同環(huán)境下微生物群落的構(gòu)成差異分析我們可以分析微生物與環(huán)境因素或宿主之間的關(guān)系，尋找標(biāo)志性菌群或特定功能的基因。對(duì)微生物群落進(jìn)行測(cè)序包括兩類(lèi)，一類(lèi)是通過(guò)16srDNA，18srDNA，ITS區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序分析微生物的群體構(gòu)成和多樣性；還有一類(lèi)是宏基因組測(cè)序，是不經(jīng)過(guò)分離培養(yǎng)微生物，而對(duì)所有微生物DNA進(jìn)行測(cè)序，從而分析微生物群落構(gòu)成，基因構(gòu)成，挖掘有應(yīng)用價(jià)值的基因資源。以

2、16srDNA擴(kuò)增進(jìn)行測(cè)序分析主要用于微生物群落多樣性和構(gòu)成的分析，目前的生物信息學(xué)分析也可以基于16srDNA的測(cè)序?qū)ξ⑸锶郝涞幕驑?gòu)成和代謝途徑進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，大大拓展了我們對(duì)于環(huán)境微生物的微生態(tài)認(rèn)知。目前我們根據(jù)16s的測(cè)序數(shù)據(jù)可以將微生物群落分類(lèi)到種（species）（一般只能對(duì)部分菌進(jìn)行種的鑒定），甚至對(duì)亞種級(jí)別進(jìn)行分析，幾個(gè)概念：16SrDNA（或16SrRNA）：16SrRNA基因是編碼原核生物核糖體小亞基的基因，長(zhǎng)度約為1542bp，其分子大小適中，突變率小，是細(xì)菌系統(tǒng)分類(lèi)學(xué)研究中最常用和最有用的標(biāo)志。16Sr

3、RNA基因序列包括9個(gè)可變區(qū)和10個(gè)保守區(qū)，保守區(qū)序列反映了物種間的親緣關(guān)系，而可變區(qū)序列則能體現(xiàn)物種間的差異。16SrRNA基因測(cè)序以細(xì)菌16SrRNA基因測(cè)序?yàn)橹?核心是研究樣品中的物種分類(lèi)、物種豐度以及系統(tǒng)進(jìn)化。OTU：operationaltaxonomicunits(OTUs)在微生物的免培養(yǎng)分析中經(jīng)常用到，通過(guò)提取樣品的總基因組DNA，利用16SrRNA或ITS的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)測(cè)序以后就可以分析樣品中的微生物多樣性，那怎么區(qū)分這些不同的序列呢，這個(gè)時(shí)候就需要引入operationaltaxonomic

4、units，一般情況下，如果序列之間，比如不同的16S文檔大全實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)rRNA序列的相似性高于97%就可以把它定義為一個(gè)OTU，每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)于一個(gè)不同的16SrRNA序列，也就是每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)于一個(gè)不同的細(xì)菌（微生物）種。通過(guò)OTU分析，就可以知道樣品中的微生物多樣性和不同微生物的豐度。測(cè)序區(qū)段：由于16srDNA較長(zhǎng)（1.5kb），我們只能對(duì)其中經(jīng)常變化的區(qū)域也就是可變區(qū)進(jìn)行測(cè)序。16srDNA包含有9個(gè)可變區(qū)，分別是v1-v9。一般我們對(duì)v3-v4雙可變區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，也有對(duì)v1-v3區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序。工具/原料·16

5、srDNA測(cè)序首先需要提取環(huán)境樣品的DNA，這些DNA可以來(lái)自土壤、糞便、空氣或水體等任何來(lái)源?！ぬ崛NA后需要經(jīng)過(guò)質(zhì)檢和純化，一般16srDNA測(cè)序擴(kuò)增對(duì)DNA的總量要求并不高，總量大于100ng，濃度大于10ng/ul一般都可以滿足要求。如果是來(lái)自和寄主共生的環(huán)境如昆蟲(chóng)的腸道微生物，提取時(shí)可能包括了寄主本身的大量DNA，對(duì)DNA的總量要求會(huì)提高。微生物菌群多樣性測(cè)序受DNA提取和擴(kuò)增影響很大，不同的擴(kuò)增區(qū)段和擴(kuò)增引物甚至PCR循環(huán)數(shù)的差異都會(huì)對(duì)結(jié)果有所影響。因而建議同一項(xiàng)目不同樣品的都采用相同的條件和測(cè)序方法，這樣相互之

6、間才存在可比性。·完成PCR之后的產(chǎn)物一般可以直接上測(cè)序儀測(cè)序，在上機(jī)測(cè)序前我們需要對(duì)所有樣本進(jìn)行定量和均一化，通常要進(jìn)行熒光定量PCR。完成定量的樣品混合后就可以上機(jī)測(cè)序?！?6srDNA測(cè)序目前可以采用多種不同的測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，包括羅氏的454，Illumina的MiSeq，Life的PGM或Pacbio的RSII三代測(cè)序儀。不同的儀器各有優(yōu)缺點(diǎn)，目前最主流的是Illumina公司的MiSeq，因?yàn)槠湓谕?、長(zhǎng)度和價(jià)格三者之間最為平衡。MiSeq測(cè)序儀可以產(chǎn)生2x300bp的測(cè)序讀長(zhǎng)，一次可以產(chǎn)生15Gb的測(cè)序數(shù)據(jù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于

7、其他測(cè)序儀的測(cè)序通量。方法/步驟文檔大全實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)1.116srDNA分析基本流程：2.2原始數(shù)據(jù)處理：原始測(cè)序數(shù)據(jù)需要去除接頭序列，并將雙端測(cè)序序列進(jìn)行拼接成單條序列。根據(jù)測(cè)序barcode序列區(qū)分不同的樣本序列。過(guò)濾低質(zhì)量序列和無(wú)法比對(duì)到16srDNA數(shù)據(jù)庫(kù)的序列。3.3OTU分類(lèi)和統(tǒng)計(jì)：OTU(operationaltaxonomicunits)是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于進(jìn)行分析，人為給某一個(gè)分類(lèi)單元（品系，種，屬，分組等）設(shè)置的同一標(biāo)志。通常按照97%的相似性閾值將序列劃分為不同的OTU，每一個(gè)OTU

8、文檔大全實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)通常被視為一個(gè)微生物物種。相似性小于97%就可以認(rèn)為屬于不同的種，相似性小于93%-95%，可以認(rèn)為屬于不同的屬。樣品中的微生物多樣性和不同微生物的豐度都是基于對(duì)OTU的分析。使用QIIME（version1.8.0）工具包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)注釋。使用QIIME（ver