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1、PCR和RT-PCRPCR和RT-PCR基礎PCR基礎聚合酶鏈式反應（PCR）過程利用模板變性，引物退火和引物延長的多個循環(huán)來擴增DNA序列。這是一個指數(shù)增長的過程，因為上一輪的擴增產(chǎn)物又作為下一輪擴增的模板，使其成為檢測核酸的一種非常靈敏的技術。一般，經(jīng)過20-30個循環(huán)得到的擴增產(chǎn)物就足夠在溴化乙錠染色的凝膠上觀察到。反應包括幾個成分（表1）。模板可以為純化的基因組或質(zhì)粒DNA；由RNA轉(zhuǎn)化得到的cDNA；或未經(jīng)純化的粗制生物樣品，如細菌克隆或噬菌斑。引物確定了擴增產(chǎn)物的序列和長度。最常用的熱穩(wěn)定聚合酶是TaqDNA聚合酶。這種酶適用于常規(guī)擴增，但
2、是使用其他熱穩(wěn)定聚合酶會改善結果。擴增反應還包括緩沖液，三磷酸脫氧核苷及鎂離子。鎂離子濃度影響酶的活性、引物退火、模板和PCR產(chǎn)物的熔點（Tm），忠實性以及引物二聚體的形成等。在隨后的章節(jié)中將討論這些成分、循環(huán)參數(shù)以及其他參與作用的因子相互間各種作用對于成功PCR的影響。表1.反應成分ComponentFinalConcentrationTemplate10^4-10^6copiesofDNAtemplatePrimer10.1-0.5μMPrimer20.1-0.5μM10XReactionbuffer1XMagnesium1.0-3.0mMdNTP
3、mix200mMeachdNTPThermostableDNApolymerase1-4units/100mlreactionRT-PCR基礎RT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結合在一起，提供了一種分析基因表達的快速靈敏的方法。RT-PCR用于對表達信息進行檢測或定量。另外，這項技術還可以用來檢測基因表達差異或不必構建cDNA文庫克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內(nèi)的RNA分析技術，更靈敏，更易于操作。RT-PCR的模板可以為總RNA或poly(A)+選擇性RNA。逆
4、轉(zhuǎn)錄反應可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶，以隨機引物、oligo(dT)或基因特異性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進行。cDNA的合成首先在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中進行，然后取出1/10的反應產(chǎn)物進行PCR。在一步法RT-PCR中，逆轉(zhuǎn)錄和PCR在同時為逆轉(zhuǎn)錄和PCR優(yōu)化的條件下，在一只管中順次進行。圖1.RT-PCR概圖這本指南闡述了成功RT-PCR和PCR的關鍵。高靈敏性（從小量樣品中得到足量結果）和高特異性（選擇性地僅得到所需的產(chǎn)物）是成功PCR的標志?？梢酝ㄟ^仔細的實驗設計（如選擇恰當?shù)拿?，設
5、計最理想的引物，使用不同的緩沖液和添加劑，確定循環(huán)參數(shù)及制備高質(zhì)量的模板等）以獲得最佳的RT-PCR和PCR。增加RT-PCR靈敏度分離高質(zhì)量RNA成功的cDNA合成來自高質(zhì)量的RNA。高質(zhì)量的RNA至少應保證全長并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。RNA的質(zhì)量決定了你能夠轉(zhuǎn)錄到cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA純化方法是使用異硫氰酸胍／酸性酚的一步法。Trizol試劑法（見下圖）將一步法加以提高，可以從多種組織和細胞中提取高質(zhì)量的非降解RNA。Trizol試劑法可以從最少100個細胞或1mg組織中提取RNA。TRIzol?試劑步驟
6、略圖一般不必使用oligo(dT)選擇性分離poly(A)+RNA。不管起始模板是總RNA還是poly(A)+RNA，都可以檢測到擴增結果（圖2）。另外，分離poly(A)+RNA會導致樣品間mRNA豐度的波動變化，從而使信息的檢出和定量產(chǎn)生偏差。然而，當分析稀有mRNA時，poly(A)+RNA會增加檢測的靈敏度。圖2.總RNA和poly(A)+RNA在RT-PCR中的比較以5或1μgHela細胞總RNA（分別為泳道1和2）或500ng和50ngHela細胞poly(A)+RNA（分別為泳道3和4）。使用oligo(dT)引物和SuperScript
7、Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。擴增對象為DNA聚合酶εmRNA5'端377bp片段和復制酶AmRNA的643bp片段，兩者都為中等豐度。將1/10的cDNA合成反應產(chǎn)物使用TaqDNA聚合酶擴增30個循環(huán)。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品（如胰臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的RNA，對于長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩(wěn)定。另外，長度大于4kb的轉(zhuǎn)錄本對于痕量RNase的降解比小轉(zhuǎn)錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩(wěn)定性，可以將
8、RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物
