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《熒光定量引物設(shè)計原則》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、引物的具體設(shè)計要求：1.引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計并具有特異性。最好位于編碼區(qū)5’端的300-400bp區(qū)域內(nèi)，可以用DNAman,Alignment軟件看看結(jié)果。2.產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)（自由能小于58.61KJ/mol）。3.引物長度一般在17-25堿基之間,上下游引物不能相差太大。4.G+C含量在40%~60%之間，45-55％最佳。5.堿基要隨機分布，盡量均勻。6.引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。7.引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。8.引物5′端可以修飾。9.3′端不可修飾，而且要避開AT,GCrich的區(qū)域，避開T/C,A/G連續(xù)結(jié)構(gòu)（2-3個）。10.引物3′端要避開
2、密碼子的第3位。11.引物整體設(shè)計自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于9KJ/mol?？捎胦ligo6軟件進行比對看結(jié)果的情況。12.做熒光定量產(chǎn)物長度80-150bp最好，最長是300bp.13.引物設(shè)計避免DNA污染，最好跨外顯子接頭區(qū)。14.引物與非特異性擴增序列的同源性最好小于70％或者有8個互補堿基同源。15.查看有無假基因的存在。假基因就是無功能的DNA序列，與需要擴增的目的片段長度相似。16.TM值在58-62度之間。17.引物設(shè)計的軟件Primer5.0有專門針對熒光的。用染料做熒光定量不如探針特異性好，具體操作一下就知道了！可以多定幾對引物，免得摸條件浪
3、費時間和金錢！試劑很貴的！熒光定量PCR引物設(shè)計原則?設(shè)計的目的是在兩個目標間取得平衡：擴增特異性和擴增效率。引物分析軟件將試圖通過使用每一引物設(shè)計變化的預(yù)定值在這兩個目標間取得平衡。設(shè)計引用有一些需要注意的基本原理：①引物長度?一般引物長度為18~30堿基。總的說來，決定引物退火溫度（Tm值）最重要的因素就是引物的長度。有以下公式可以用于粗略計算引物的退火溫度。?在引物長度小于20bp時：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃?在引物長度大于20bp時：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃?另外有許多軟件也可以對退火溫度進行計算，其計算原理會各有不同，因此有時
4、計算出的數(shù)值可能會有少量差距。為了優(yōu)化PCR反應(yīng)，使用確保退火溫度不低于54℃的最短的引物可獲得最好的效率和特異性。?總的說來，每增加一個核苷酸引物特異性提高4倍，這樣，大多數(shù)應(yīng)用的最短引物長度為18個核苷酸。引物長度的上限并不很重要，主要與反應(yīng)效率有關(guān)。由于熵的原因，引物越長，它退火結(jié)合到靶DNA上形成供DNA聚合酶結(jié)合的穩(wěn)定雙鏈模板的速率越小。?②GC含量?一般引物序列中G+C含量一般為40%~60%，一對引物的GC含量和Tm值應(yīng)該協(xié)調(diào)。若是引物存在嚴重的GC傾向或AT傾向則可以在引物5’端加適量的A、T或G、C尾巴。?③退火溫度?退火溫度需要比解鏈溫度低5℃，如果引物堿基數(shù)較少，
5、可以適當提高退火溫度，這樣可以使PCR的特異性增加；如果堿基數(shù)較多，那么可以適當減低退火溫度，是DNA雙鏈結(jié)合。一對引物的退火溫度相差4℃～6℃不會影響PCR的產(chǎn)率，但是理想情況下一對引物的退火溫度是一樣的，可以在55℃～75℃間變化。?④避免擴增模板的二級結(jié)構(gòu)區(qū)域?選擇擴增片段時最好避開模板的二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)計算機軟件可以預(yù)測估計目的片段的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區(qū)域自由能（△G）小于58.6lkJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時，用7-deaza-2’-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。?⑤與靶DNA的錯配?當被擴增的靶DNA序
6、列較大的時候，一個引物就有可能與靶DNA的多個地方結(jié)合，造成結(jié)果中有多個條帶出現(xiàn)。這個時候有必要先使用BLAST軟件進行檢測，網(wǎng)址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。選擇Aligntwosequences(bl2seq)，如下圖。BLAST的使用方法也十分簡單，如下圖所示。將引物序列粘貼到1區(qū)，將靶DNA序列粘貼到2區(qū)，這兩者可以互換的，并且BLAST會計算互補、反義鏈等多種可能，所以不需要用戶注意兩條鏈是否都是有義鏈。如果知道序列在數(shù)據(jù)庫中的GI號也可以直接輸入GI號，這樣就不用粘貼一大段的序列了。最后在3處點擊Align就可以查看引物在靶DNA中
7、是否有多個同源位點了。?可是使用BLAST還是有其不方便的地方。因為它一次只能比較兩條序列，那么一對引物就需要分開進行比對。如果存在錯配，還需要自己計算由于錯配形成的片段長度有多大。在下一篇中將介紹一個軟件，可以直接將靶DNA和引物輸入對產(chǎn)物片段進行預(yù)測。?⑥引物末端?引物3’端是延伸開始的地方，因此要防止錯配就從這里開始。3’端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在G+C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。3′端也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)可能，除在特殊的P
