熒光定量pcr引物設(shè)計(jì)要求

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1、熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)要求熒光定量PCR引物的具體設(shè)計(jì)要求：1.引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。最好位于編碼區(qū)5’端的300-400bp區(qū)域內(nèi)，可以用DNAman,Alignment軟件看看結(jié)果。2.產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)(自由能小于58.61KJ/mol)。3.引物長(zhǎng)度一般在17-25堿基之間,上下游引物不能相差太大。4.G+C含量在40%~60%之間，45-55%最佳。5.堿基要隨機(jī)分布，盡量均勻。6.引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。7.引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。8.引物5′端可以修飾。9.3′端不可修飾，而且要避開(kāi)AT,GCr

2、ich的區(qū)域，避開(kāi)T/C,A/G連續(xù)結(jié)構(gòu)(2-3個(gè))。10.引物3′端要避開(kāi)密碼子的第3位。11.引物整體設(shè)計(jì)自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于9KJ/mol?？捎胦ligo6軟件進(jìn)行比對(duì)看結(jié)果的情況。12.做熒光定量產(chǎn)物長(zhǎng)度80-150bp最好，最長(zhǎng)是300bp.13.引物設(shè)計(jì)避免DNA污染，最好跨外顯子接頭區(qū)。14.引物與非特異性擴(kuò)增序列的同源性最好小于70%或者有8個(gè)互補(bǔ)堿基同源。15.查看有無(wú)假基因的存在。假基因就是無(wú)功能的DNA序列，與需要擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度相似。16.TM值在58-62度之間。17.引物設(shè)計(jì)的軟件Prime

3、r5.0有專門針對(duì)熒光的。ATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCCGTTTATCACCACTGACTACATGACATATATGTTCAAGTATGACACTGTTCATGGACAATGGAAGCATCATGAGCTTAAGGTCAAGGATGAGAAGACTCTTCTCTTCGGTGAGAAGCCAGTCACTGTTTTTGGCATCAGAAACCCTGAAGATATCCCATGGGGTGAGGCTGGGGCTGACTTTGTGGTCGAGTCCACTGGAGTCTTCACAGACAAAGACAAAGCTGCTGCCCATTTGA

4、AGGGTGGTGCAAAGAAAGTCATCATCTCTGCTCCTAGCAAAGATGCTCCCATGTTTGTTATGGGTGTCAACGAGAAGGAATACACACCCGAGCTTAACATTGTTTCAAATGCCAGCTGTACAACCAACTGCCTTGCTCCCTTGGCCAAGGTCATAAACGACAGGTTTGGCATTGTTGAGGGTCTTATGACAACTGTGCACGCTATGGCTGCCACTCAAAAGACTGTTGATGGTCCATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAG5'GAGAAGGAATACAC

5、ACCCGAGC3'5'GACCACAAAGTCAGCCCCAG3'ATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCCGTTTATCACCACTGACTACATGACATATATGTTCAAGTATGACACTGTTCATGGACAATGGAAGCATCATGAGCTTAAGGTCAAGGATGAGAAGACTCTTCTCTTCGGTGAGAAGCCAGTCACTGTTTTTGGCATCAGAAACCCTGAAGATATCCCATGGGGTGAGGCTGGGGCTGACTTTGTGGTCGAGTCCACTGGAGTCTTCACAGACAAAG

6、ACAAAGCTGCTGCCCATTTGAAGGGTGGTGCAAAGAAAGTCATCATCTCTGCTCCTAGCAAAGATGCTCCCATGTTTGTTATGGGTGTCAACGAGAAGGAATACACACCCGAGCTTAACATTGTTTCAAATGCCAGCTGTACAACCAACTGCCTTGCTCCCTTGGCCAAGGTCATAAACGACAGGTTTGGCATTGTTGAGGGTCTTATGACAACTGTGCACGCTATGGCTGCCACTCAAAAGACTGTTGATGGTCCATCAATGAAGGACTGGAGAGGT

7、GGAAG5'GAGAAGGAATACACACCCGAGC3'5'CAACAGTCTTTTGAGTGGCAG3'5'GAGAAGGAATACACACCCGAGC3'5'GCACAGTTGTCATAAGACCCTCAAC3'5'GAGAAGGAATACACACCCGAGC3'5'GACCCTCAACAATGCCAAACC3'5'CAACGAGAAGGAATACACACC3'5'ACCCTCAACAATGCCAAAC3'TKGAPDH內(nèi)參qRT-PCR引物的設(shè)計(jì)如下：1.119bpATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCCGTTTATCA

8、CCACTGACTACATGACATATATGTTCAAGTATGACACTGTTCATGGACAATGGA