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《WB免疫印跡實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題全歸納》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、【干貨收藏貼】WB常見(jiàn)問(wèn)題精品全集錦?做了很久的WB（westernblot），走了很多彎路，但是WB想要做好并不難，總結(jié)WB實(shí)驗(yàn)中可能會(huì)遇到的問(wèn)題，分析可能的原因及對(duì)應(yīng)的解決方案，這就是實(shí)驗(yàn)成功的基石。以下，我們先解決很多技術(shù)菌的疑惑，然后再著手匯總實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)問(wèn)題和可能原因分析以及給出建議解決方案。?WB常見(jiàn)問(wèn)題分析1.為什么我的細(xì)胞提取液中沒(méi)有檢測(cè)到目的蛋白？原因有很多：a)細(xì)胞中不表達(dá)這種蛋白質(zhì)，換一種細(xì)胞；b)細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被降解掉了，可加入蛋白酶抑制劑，抑制蛋白酶活性；c)抗體不能識(shí)別目標(biāo)蛋白，多看看說(shuō)明，是否有問(wèn)題；d)酶降解可能是沒(méi)有保持低溫操作，樣品保存不當(dāng)，樣品放
2、置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。2.我做的蛋白質(zhì)分子量很?。?0KDa），請(qǐng)問(wèn)怎么做WB？a)可以選擇PSQ膜，同時(shí)縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉(zhuǎn)移。其他按步驟即可；b)也可選擇孔徑0.22um的PVDF膜或者NC膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間縮短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE體系。3.我的目的帶很弱，如何加強(qiáng)？a)可以加大抗原上樣量，這是最主要的；b)也可以將一抗稀釋比例降低；c)還可以延長(zhǎng)曝光時(shí)間。4.DAB好還是ECL好？DAB有毒，但是比較靈敏，是HRP最敏感的底物；ECL結(jié)果容易控制，但被催化時(shí)靈敏度差一點(diǎn)，但如果達(dá)到閥值，就特別靈敏，可以檢測(cè)pg級(jí)抗原。5.膠片是一片空白，是怎么回
3、事？如果能夠排除下面的幾個(gè)問(wèn)題那么問(wèn)題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。a)二抗的HRP活性太強(qiáng)，將底物消耗光；b)ECM底物中H2O2，不穩(wěn)定，失活；c)ECL底物沒(méi)覆蓋到相應(yīng)位置；d)?一抗選擇不當(dāng)二抗失活；e)?二抗失活。6.磷酸化抗體的檢測(cè)樣本制備時(shí)是否一定要加NaF等？NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也可以，大部分時(shí)候是不用加的。7.細(xì)胞水平要做WB，多少細(xì)胞提的蛋白夠做WB？一般5×106就足夠。8.如果上樣量超載，要用什么方法來(lái)增加上樣量？可以濃縮樣品，也可以根據(jù)目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30％是不會(huì)有問(wèn)題的。如果已經(jīng)超了不少了，而
4、且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm的。9.大分子量蛋白200KDa，在做WB要注意什么？a)?做200kd蛋白的WB時(shí)要注意，分離膠最好選擇>7%的；剝膠時(shí)要小心；b)?轉(zhuǎn)移時(shí)間需要相應(yīng)延長(zhǎng)；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）。c)?轉(zhuǎn)膜液中甲醇含量可適當(dāng)降低，推薦使用濕裝轉(zhuǎn)膜效率更高哦!10.免疫組化和WB可以用同一種抗體嗎？免疫組化時(shí)抗體識(shí)別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會(huì)消失。如果所用的抗體識(shí)別的是
5、蛋白上連續(xù)的幾個(gè)氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時(shí)用于免疫組化和WB，而如果抗體識(shí)別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。11.WB中抗體的可以重復(fù)應(yīng)用嗎？抗體工作溶液一般不主張儲(chǔ)存反復(fù)使用，但是如抗體比較珍貴，可反復(fù)使用2－3次。稀釋后應(yīng)在2－3天內(nèi)使用，4度保存，避免反復(fù)凍融。12.上下槽緩沖液有何要求，怎樣才能達(dá)到最佳效果？無(wú)特殊要求。但一般是上槽放新鮮的緩沖液，下槽可以是重復(fù)使用過(guò)一兩次的緩沖液。?WB實(shí)驗(yàn)中常會(huì)出現(xiàn)各種問(wèn)題，也跟技術(shù)菌們一起分享下WB實(shí)驗(yàn)中各種問(wèn)題及應(yīng)用對(duì)策，希望給您的實(shí)驗(yàn)帶來(lái)實(shí)實(shí)在在的幫助~WB問(wèn)題匯總及解決建議問(wèn)題原因解決方案條帶形狀不好看??膠凝的
6、不均勻，聚合不好灌膠前將溶液充分混勻某些樣品鹽濃度較高除鹽或?qū)悠符}濃度調(diào)成一致緩沖液陳舊，成分改變重配凝膠下面有氣泡電泳前先將氣泡趕走電泳時(shí)溫度過(guò)高降低電流或電壓樣品中含有不溶性顆粒樣品充分?jǐn)嚢杌靹螂姌O不平衡或者加樣位置偏斜調(diào)整電極和加樣蛋白條帶信號(hào)弱樣品上樣量不足或目的蛋白濃度過(guò)低加大上樣量或濃縮樣品轉(zhuǎn)移不完全或過(guò)轉(zhuǎn)移可以用麗春紅染膜并結(jié)合染膠（考馬斯亮藍(lán)）后確定條帶是否轉(zhuǎn)至膜上或轉(zhuǎn)移過(guò)頭；適當(dāng)調(diào)整轉(zhuǎn)膜的時(shí)間和電流抗體濃度低增加抗體濃度或延長(zhǎng)孵育時(shí)間封閉過(guò)度減少封閉劑的量或縮短時(shí)間，換用不同封閉劑類型顯色劑失效更換顯色劑（吸取A、B液的槍頭不可混用）顯色或曝光時(shí)間不足延長(zhǎng)顯色或
7、曝光時(shí)間HRP抑制劑所用溶液和容器內(nèi)避免含有疊氮化鈉轉(zhuǎn)膜效率低?轉(zhuǎn)膜緩沖液pH值與目的蛋白等電點(diǎn)相近提高轉(zhuǎn)膜緩沖液pH值凝膠與膜之間存在氣泡轉(zhuǎn)膜前要排盡氣泡轉(zhuǎn)印膜種類選擇不當(dāng)使用質(zhì)量可靠的PVDF膜或硝酸纖維素膜電壓或電流過(guò)小濕轉(zhuǎn)時(shí)20mA恒流，半干轉(zhuǎn)時(shí)25V左右恒壓轉(zhuǎn)印時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短根據(jù)蛋白大小及轉(zhuǎn)印裝置選擇合適的轉(zhuǎn)印時(shí)間濕轉(zhuǎn)過(guò)程中環(huán)境溫度過(guò)高使用預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液或?qū)⒀b置至于4度顯色或曝光后無(wú)條帶選用的一抗、二抗及顯色方法不合適選擇合適的一抗、二抗和顯色方法目的蛋白
