高性能淀粉酶菌株的篩選開(kāi)題報(bào)告

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1、開(kāi)題報(bào)告高性能淀粉酶菌株的篩選1選題的背景和意義淀粉酶是能催化淀粉和糖原水解轉(zhuǎn)化成葡萄糖、麥芽糖及其它低聚糖的一類酶的總稱，在淀粉糖工業(yè)、食品工業(yè)、醫(yī)藥、紡織、洗滌劑、青貯飼料、微生態(tài)制劑以及釀酒行業(yè)中被廣泛應(yīng)用。淀粉酶是最早用于工業(yè)化生產(chǎn)并且迄今為止仍是用途最廣、產(chǎn)量最大的酶制劑產(chǎn)品之一[1、2]。不同種類的淀粉酶水解淀粉會(huì)生成不同的產(chǎn)物。根據(jù)淀粉酶水解淀粉的作用方式可分為α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和異淀粉酶。α-淀粉酶能隨機(jī)地作用于淀粉的非還原端，生成麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，所得產(chǎn)物的還原性末端葡萄糖單位碳原子為α構(gòu)型，同時(shí)該酶能使淀粉漿的粘

2、度下降，又稱為液化酶；β-淀粉酶是從淀粉的非還原性末端切下一分子的麥芽糖，又被稱為糖化酶，其產(chǎn)物還原性末端葡萄糖單位碳原子為β構(gòu)型；葡萄糖淀粉酶是從底物非還原末端依次水解α-l，4糖苷鍵和分支的α-1，6-糖苷鍵，生成葡萄糖。異淀粉酶是只水解糖原或支鏈淀粉分支點(diǎn)的α-1，6-糖苷鍵，切下側(cè)枝鏈[3]。淀粉酶是工業(yè)中最重要的酶。如今，在生物制藥領(lǐng)域，它也具有重要的作用。雖然淀粉酶具有很多來(lái)源，但是微生物來(lái)源的淀粉酶，特別是α-淀粉酶和葡糖淀粉酶，在商業(yè)上發(fā)揮著重要的作用。由于淀粉是可以由淀粉酶水解的惟一天然物質(zhì)，分離有效的微生物菌株生產(chǎn)對(duì)生淀粉有效性高的淀粉酶是非常

3、理想的。應(yīng)用新的耐熱性葡糖淀粉酶可以促進(jìn)淀粉的水解過(guò)程，而使用α-淀粉酶可以使整個(gè)過(guò)程一步便可以完成，具有經(jīng)濟(jì)效益?，F(xiàn)在，必須開(kāi)發(fā)具有雙重功效的，如液化作用和糖化作用的微生物菌株如淀粉分解酵母。也應(yīng)該開(kāi)發(fā)具有有效β-淀粉酶活性的菌株，β-淀粉酶可以用來(lái)生產(chǎn)麥芽糖漿?？梢杂棉r(nóng)業(yè)和工業(yè)上的廢物作為淀粉酶生產(chǎn)的底物，從而降低開(kāi)支，也解決了廢物的處理和污染問(wèn)題。在工業(yè)上的作用，淀粉酶的耐熱性已成為非常重要的性質(zhì)，因此，我們也應(yīng)該努力從耐熱和極端耐熱的微生物中生產(chǎn)淀粉酶。另外，將淀粉酶的應(yīng)用范圍拓寬如應(yīng)用于生物制藥領(lǐng)域也具有積極的意義。72相關(guān)研究的最新成果及動(dòng)態(tài)2.1α-

4、淀粉酶的催化機(jī)理目前公認(rèn)的α-淀粉酶的催化機(jī)理[4]，催化中心位于α/β桶狀結(jié)構(gòu)的底部，261位谷氨酸和231位天冬氨酸是起催化作用的兩個(gè)重要?dú)埢Ｕ麄€(gè)催化過(guò)程可分三步：第一步，淀粉鏈中的糖苷氧被質(zhì)子供體261谷氨酸質(zhì)子化；第二步，親核基團(tuán)231位天冬氨酸親核攻擊葡萄糖殘基的C1，糖苷鍵斷裂，葡萄糖殘基與231位天冬氨酸形成酯鍵，同時(shí)去質(zhì)子化狀態(tài)的261位谷氨酸奪取一個(gè)水分子H+，產(chǎn)生一個(gè)OH-；第三步，OH-攻擊葡萄糖殘基的C1，使酯鍵斷裂，261位谷氨酸和231位天冬氨酸重新恢復(fù)初始狀態(tài)。在已知結(jié)構(gòu)的α-淀粉酶中，在α/β桶狀結(jié)構(gòu)的底部，均含有谷氨酸和天冬氨酸

5、兩個(gè)殘基，它們的相對(duì)位置相似，并且所有α-淀粉酶的整體三維結(jié)構(gòu)都很相似，因此，它們的催化反應(yīng)機(jī)理應(yīng)該是相同或相近的[4、5]。以對(duì)α-淀粉酶分子結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理的研究為基礎(chǔ)，通過(guò)各種手段改善酶的催化反應(yīng)特異性，使其更適合于在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用是近年來(lái)新興的發(fā)展趨勢(shì)。2.2α-淀粉酶的突變研究目前應(yīng)用得最廣泛的基因水平上的突變主要有兩種，即隨機(jī)突變和定點(diǎn)突變，有時(shí)也將兩種方法結(jié)合使用。隨機(jī)突變首先需構(gòu)建突變文庫(kù)，然后根據(jù)研究酶的特點(diǎn)設(shè)計(jì)高通量的篩選方法。它的優(yōu)點(diǎn)是不必明確知道酶的三維結(jié)構(gòu)、催化機(jī)理等。定點(diǎn)突變需要對(duì)酶的結(jié)構(gòu)機(jī)理有較明確的認(rèn)識(shí)，它更適用于研究單個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)對(duì)

6、酶分子的影響。將這些方法應(yīng)用于α-淀粉酶的研究已有一定進(jìn)展。目前有關(guān)突變的研究大多針對(duì)于地衣芽胞桿菌活菌，如Takase研究發(fā)現(xiàn)天冬酰胺326賴氨酸/天冬氨酸能夠顯著改變地衣芽胞桿菌活菌的pH特性。NielsenJE等對(duì)地衣芽胞桿菌活菌進(jìn)行定點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺264絲氨酸和天冬酰胺190苯丙氨酸能提高地衣芽胞桿菌活菌的熱穩(wěn)定性。ShawA等通過(guò)隨機(jī)突變，得到Met15Thr,能增強(qiáng)地衣芽胞桿菌活菌的穩(wěn)定性，在此突變的基礎(chǔ)上進(jìn)行隨機(jī)突變，發(fā)現(xiàn)Met15Thr和天冬酰胺188絲氨酸使地衣芽胞桿菌活菌熱穩(wěn)定性提高2倍[6]。但目前就氨基酸突變?nèi)绾螌?dǎo)致酶宏觀性質(zhì)的改變說(shuō)

7、法不一，還有待進(jìn)一步研究。2.3基因克隆及氨基酸序列7分子生物技術(shù)的發(fā)展，對(duì)α-淀粉酶的研究已進(jìn)入分子水平階段，在α-淀粉酶的氨基酸序列分析、基因編碼及核苷酸序列分析、基因克隆和基因性狀表達(dá)等方面都取得較大的進(jìn)展，基因工程技術(shù)已廣泛應(yīng)用到了淀粉酶生產(chǎn)菌株的克隆上，并且在不同微生物的α-淀粉酶基因克隆方面已經(jīng)作了大量的工作，主要在大腸桿菌等。Suganumaetal.研究了α-淀粉酶的N-端氨基酸序列。Kimetal.描述了編碼一種新α-淀粉酶的基因，該基因被克隆并在大腸桿菌中表達(dá)[7]。Steyn和Pretorius編碼α-淀粉酶基因(AMY)編碼GA的基因(ST

8、A2)轉(zhuǎn)入