鴨甲肝病毒1型間接ELISA和CLEIA抗體檢測(cè)方法的建立.pdf

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1、巧古單化論義鵬甲肝病毒１型間接化ＩＳＡ巧ＣＬＥＩＡ抗體檢測(cè)方法的建立銀鳳桂爲(wèi)爲(wèi)乂爹二〇—六年六月■２５＋９分類號(hào)Ｓ８．６５．６密級(jí)公開ＵＤＣ６３６．５碩ｉ學(xué)位論文鴨甲肝病毒１型間接化ＩＳＡ和化ＥＩＡ抗體檢測(cè)方法的建立銀鳳桂學(xué)科專業(yè)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師劉義軍研究員副導(dǎo)師李晶助理研究員論文答辯日期２０１６年５月２１日學(xué)位授予日期２０１６年６月３０日答辯委員會(huì)主席楊威研究員廣西大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性和使用授權(quán)聲明本人聲明所呈交的論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下獨(dú)立進(jìn)行研究所取得的研究成

2、果。除已特別加Ｗ標(biāo)注和致謝的地方外，論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫的研究成果，也不包含本人或他人為獲得廣西大一學(xué)或其它單位的學(xué)位而使用過(guò)的材料。與我同工作的同事對(duì)本論文的研巧工作所做的貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確說(shuō)明。本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下所完成的學(xué)位論文及相關(guān)的職務(wù)作品，知識(shí)產(chǎn)權(quán)歸屬?gòu)V西大學(xué)。本人授權(quán)廣西大學(xué)擁有學(xué)位論文的部分使用權(quán)，即；學(xué)校有權(quán)保存并向國(guó)家有關(guān)部口或機(jī)構(gòu)送交學(xué)位論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱，可Ｗ將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索和傳播。，可Ｗ采用影印、縮印或其它復(fù)制手段保存、匯

3、編學(xué)位論文本學(xué)位論文屬于：□保密。，在年解密后適用授權(quán)口不保密。＂＂（請(qǐng)?jiān)冢咨舷鄳?yīng)方框內(nèi)打Ｖ）論文作者簽名良ｇＭ日期：斗ＷＩ．指導(dǎo)教師簽名：＞ｉ豕曰期《本巧］）作者聯(lián)系電話：電子郵箱：１ＥＬＩＳＡＡ鴨甲肝病毒型間接和化ＥＩ抗體檢測(cè)方法的建立摘要鴨病毒性肝炎（Ｄｕｃｋｖｉｒａｌｈｅｐａｔｉｔｉｓ，ＤＶＨ）是由鴨肝炎病毒（Ｄｕｄｅｈｅｐａｔｉｔｉｓｖ一ｉｍｓ，ＤＨＶ引起的種高致死率的傳染病，主要感染２１日齡ｙＸ內(nèi)的維鴨，）引起典型的肝炎癥狀，維鴨死亡率高達(dá)８０％１＾上且傳播迅速，給養(yǎng)禽業(yè)生產(chǎn)造

4、成了極大的損失。在鴨肝炎病毒感染的檢測(cè)與診斷方面，主要采用?。崳姸痉蛛x、病毒中和試驗(yàn)［＾及病毒核酸檢測(cè)等方法，雖各有優(yōu)點(diǎn)，但耗時(shí)較－，。長(zhǎng)無(wú)法滿足大批量檢測(cè)的需求因此，本研究選擇我國(guó)ＤＨＡＶ１流行株的結(jié)構(gòu)蛋白ＶＰ１進(jìn)行了克隆和原核表達(dá)，純化后的ＶＰ１蛋白作為檢測(cè)抗原，建立了針對(duì)鴨甲肝病毒１型血清抗體的間接ＥＬＩＳＡ方法和化學(xué)發(fā)光酶免疫分析ＣＬＥＩＡ快速檢測(cè)方法。（）１．鴨甲肝病毒１型ＶＰ１基因的克隆與表達(dá)－－ＶＰ本研究利用ＲＴＰＣ民技術(shù)，ＤＨＡＶ１ＲＮＡ為模板，１基因擴(kuò)增出，－－－－基因片段長(zhǎng)７１４ｂｐ。構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒ＥＴ２８ａ

5、ＶＰｌ和ＥＴ３２ａＶＰｌ，并ｐｐ－－－摸索其表達(dá)條件－：將重組表達(dá)質(zhì)粒ｐＥＴ２８ａＶＰｌ和ｐＥＴ３２ａＶＰｌ分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株Ｒ〇ｓｅｔａＤＥ３中，選用不同的ＩＰＴＧ濃度和誘導(dǎo)時(shí)間，（）－進(jìn)行重姐蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)ＳＤＳＰＡＧＥ電泳分析鑒定。結(jié)果表－－；ＶＰ１基因在Ｔ２８ａ和Ｔ３２ａ均獲得表達(dá)明昨陽(yáng)，表達(dá)的重組蛋白大小分別－－為：２７ｋＤａ、４７ｋＤａ。本研究選擇表達(dá)量較高的ＥＴ３２ａＶＰｌ原核表ｐ達(dá)質(zhì)粒，Ｉ－ＶＰｌ重組蛋白進(jìn)行純化－利用ＮｉＮＴＡ親和層析對(duì)，ＳＤＳＰＡＧＥ電泳結(jié)果顯。示純度達(dá)到９５％Ｗ上，

6、可用作檢測(cè)抗原２．鴨甲肝病毒１型抗體檢測(cè)間接ＥＬＩＳＡ和ＣＬＥＩＡ方法的建立建立的間接化ＩＳＡ方法和ＣＬＥＩＡ方法，特異性均為１００％；板內(nèi)重復(fù)性－－．．％重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的變實(shí)驗(yàn)的變異系數(shù)分別為：１．１６％４８％、２．２７％２５５；板間－２－．巧％８．６％２．１８％４．巧％異系數(shù)分別為：、；說(shuō)明這兩種方法具有較高的持異性和穩(wěn)定性，且ＣＬＥＩＡ方法靈敏度和重復(fù)性優(yōu)于間接ＥＬＩＳＡ方法，為一－ＤＨＡＶ１的診斷提供種良好的檢測(cè)方法。關(guān)鍵詞：鴨甲肝病毒１型ＶＰ１基因原核表達(dá)間接ＥＬＩＳＡＣＬＥＩＡＩＩＥＳＴＡＢＬＩＳＨＭＥＮＴＯＦＩＮＤ

7、ＩＲＥＣＴＥＬＩＳＡＡＮＤＣＬＥＩＡＦＯＲＤＥＴＥＣＴＩＮＧＴＨＥＡＮＴＩＢＯＤＹＯＦＤＵＣＫＨＥＰＡＴ打ＩＳＡＶＩＲＵＳＴＹＰＥ１ＡＢＳＴＲＡＣＴＤｕｃｋｖｉｒａｌｈｅａｔｉｔｉｓＤＶＨｉｓａｎｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｏｆｈｉｈｍｏｒｔａｌｉｔｃａｕｓｅｄｐ（）ｇｙｂｄｕｃｋｈｅａｔｉｔｉｓｖｉｍｓＤＨＶｗｈｉｃｈｒｉｍａｒｉｌｉｎｆｅｄｅｄｄｕｃｋｌｉｎｓｗｉｔｈ２１ｄａｓｙｐ（），ｐｙｇｙｏｌｄ．ＤＨＶｌｅａｄｓｔｉｃａｌｈｅａｔｉｔｉｓｓｍｔｏｍｓ

8、ｉｎｄｕｃｋｗｉｔｈ