反相液相色譜鬼峰來源.pdf

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1、反相液相色譜鬼峰來源2016-07-26作者：BruceLee來源：藥渡網(wǎng)1.概述在反相液相色譜分析方法開發(fā)過程中，采用等度洗脫時(shí)，先洗脫組分的色譜峰峰寬較窄，后洗脫組分的色譜峰峰寬較寬；而梯度洗脫方式，則具有分析時(shí)間短(特別是對(duì)于樣品組分復(fù)雜的情況來說)，在梯度范圍內(nèi)各色譜峰的峰寬近乎一致等特點(diǎn)。梯度洗脫時(shí)色譜峰縱向擴(kuò)展可控特點(diǎn)，可參考下圖1進(jìn)行理解?；|(zhì)或者樣品組分比較復(fù)雜時(shí)，梯度洗脫是反相液相色譜最常用的操作模式，而主要在梯度洗脫中出現(xiàn)的鬼峰是特別讓人頭疼的。有可能由于來源排查不清以及解決方案不到位而導(dǎo)致原來的方法在實(shí)際的應(yīng)用與轉(zhuǎn)移過程中出現(xiàn)問題，甚至面臨重新開發(fā)方法

2、的尷尬境地。鬼峰意即來源不清，不可指認(rèn)，時(shí)有時(shí)無，對(duì)目標(biāo)峰或者樣品純度測試產(chǎn)生干擾作用的峰，如下圖2所示，即為典型的鬼峰，一般來講，鬼峰的出現(xiàn)與色譜柱無關(guān)(當(dāng)然，梯度洗脫時(shí)，梯度設(shè)置不合適的情況除外)。對(duì)于含量或者純度檢測方法而言，在主峰位置或附近出現(xiàn)鬼峰的話，影響到方法的專屬性以及檢測結(jié)果準(zhǔn)確性(如下圖3)。特別地，對(duì)于藥物制劑或者API的純度測試來說，要求對(duì)降解產(chǎn)生的雜質(zhì)之外的雜質(zhì)來源做出較詳細(xì)的說明(如反應(yīng)副產(chǎn)物或者反應(yīng)原料帶入等)。鬼峰的出現(xiàn)，可能增加此項(xiàng)工作的難度與工作量。此外，鬼峰需要與梯度洗脫時(shí)由于梯度的突然變化引起的梯度峰進(jìn)行區(qū)分，如下圖4所示，在20min

3、處由于梯度的陡然變化，造成流動(dòng)相組成的急劇改變引起流動(dòng)相折光特性發(fā)生很大的變化，而出現(xiàn)梯度峰(其峰形與所定的檢測波長有關(guān))。在梯度洗脫模式下，可以通過避免突然大范圍改變流動(dòng)相的組成來避免尖銳的梯度峰的出現(xiàn)，同時(shí)也有助于減少泵的故障率。2.鬼峰來源與解決方案鬼峰來源多種多樣，理論上講，在HPLC系統(tǒng)中任何一個(gè)節(jié)點(diǎn)均有可能引入鬼峰，依據(jù)鬼峰出現(xiàn)的頻率，其主要來源于流動(dòng)相部分，樣品制備以及自動(dòng)進(jìn)樣部分，儀器流路及檢測器部分等，如下圖5所示。2.1儀器流路及檢測器引起的鬼峰儀器流路中的殘留氣泡可以引起鬼峰，保留時(shí)間一般不可重現(xiàn)，即使流路中氣泡連續(xù)存在，鬼峰出現(xiàn)的位置亦不可預(yù)測。可將

4、流動(dòng)相超聲或鼓He脫除氣泡并打開purge閥，大流速?zèng)_出儀器管路中的氣泡，來減少氣泡引起的鬼峰現(xiàn)象。由泵的混合或者泵的突然切換引入的鬼峰一般發(fā)生在梯度峰及其之后位置，在低壓混合模式下出現(xiàn)的可能性更大。實(shí)際應(yīng)用中(無論是高壓混合模式還是低壓混合模式)，梯度峰之后經(jīng)常是不被關(guān)注的地方，如下圖6。同一臺(tái)儀器，可通過進(jìn)樣Blank或檢查紫外吸收光譜，確認(rèn)其是否為鬼峰。在不影響分析方法目的以及對(duì)結(jié)果判斷的情況下，可不用對(duì)此過于糾結(jié)。檢測器處引入的鬼峰，多為一些樣品組分在檢測器流通池內(nèi)的殘留，其特點(diǎn)具有先后針之間的重復(fù)性差，或者沒有重復(fù)性，色譜峰峰形特別尖銳類似大的毛刺。該種情形下，需

5、要對(duì)流通池特別是石英視窗進(jìn)行徹底清洗(聯(lián)系工程師或者嚴(yán)格按照manual進(jìn)行)?；旌掀鞅旧碛袝r(shí)也會(huì)引入鬼峰，如下圖所示同樣的流動(dòng)相，在系統(tǒng)流路的不同位置(分別為混合器前面與后面)添加污染物捕集裝置，對(duì)基線進(jìn)行監(jiān)測如下圖7所示。從圖中可以明確看出混合器由于被污染而在色譜圖上引入了鬼峰。此外，同一臺(tái)儀器經(jīng)常在不同的流動(dòng)相體系之間進(jìn)行切換的時(shí)候，特別需要注意整個(gè)儀器管路內(nèi)的污染物殘留。當(dāng)懷疑儀器流路內(nèi)壁被殘留物污染時(shí)，可用水：乙腈：異丙醇：甲醇=1：1：1：1的比例，以1mL/min的流速?zèng)_洗整個(gè)流路2h以上，可將流路內(nèi)的污染物殘留沖洗完全。2.2樣品制備以及自動(dòng)進(jìn)樣引入的鬼峰由

6、樣品制備引入的鬼峰，多集中與使用了不干凈被污染的溶劑或者不干凈的進(jìn)樣小瓶(如下圖8)。這種情況下的鬼峰，容易排除，僅需要分別將樣品溶解或稀釋用的試劑以及進(jìn)樣小瓶更換，即可確定鬼峰的來源。此外，由自動(dòng)進(jìn)樣器引入的鬼峰，也不在少數(shù)。自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣的流程(如下圖9)所示。在進(jìn)樣之后，部分樣品溶液殘留在進(jìn)樣針頭以及針座之上，對(duì)下次進(jìn)樣別的樣品的結(jié)果產(chǎn)生干擾，出現(xiàn)鬼峰。對(duì)于一些強(qiáng)吸附性組分，盡管進(jìn)行程序洗針，有時(shí)依然可能會(huì)引入鬼峰。針對(duì)這種情形，可在儀器平衡之后，分別進(jìn)樣不同試劑的Blank以及不進(jìn)樣，比較得到的圖譜，基本可確定鬼峰是否來源于進(jìn)樣過程。2.3流動(dòng)相引入的鬼峰在實(shí)際的應(yīng)

7、用中，鬼峰最主要來源為流動(dòng)相，包括水相，有機(jī)相，有機(jī)酸堿添加劑，緩沖鹽以及流動(dòng)相瓶等，(如下圖10)所示。其中水相引入的鬼峰是最常見的，水中含有的有機(jī)，無機(jī)雜質(zhì)均有可能對(duì)檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾，出現(xiàn)鬼峰。水相引入鬼峰的可能原因有：水中本來含有的有機(jī)，無機(jī)雜質(zhì)；水相在使用過程中有塵?；蛘呖諝庵械挠袡C(jī)物落入或溶解進(jìn)去；水相在存放或使用的過程中，細(xì)菌等微生物滋生等。有機(jī)相如甲醇，乙腈，四氫呋喃等，亦有可能引入鬼峰(如上圖10所示)。有機(jī)相引入的鬼峰，原因多為有機(jī)相使用完之后未更換新的流動(dòng)相瓶，而是直接添加補(bǔ)充的方式；以及流動(dòng)相